IF 16.6，Nature Communications│代谢酶CD73在肿瘤自主和自分泌方式下对胰腺癌免疫抑制的转录调节

前言：

2023年6月8日，浙江大学梁廷波及黄星共同通讯在Nature Communications发表题为“Transcriptional control of pancreatic cancer immunosuppression by metabolic enzyme CD73 in a tumor-autonomous and -autocrine manner”的研究论文，该研究证明CD73在胰腺癌免疫抑制中的兼职功能，这是一种以肿瘤代谢、免疫微环境和免疫治疗耐药性之间复杂的串扰为特征的理想模型。在多种胰腺癌模型中观察到CD73特异性药物与免疫检查点阻断相结合的协同作用。

背景介绍：

代谢重编程是肿瘤细胞的一个标志，在各种恶性肿瘤的免疫耐受和免疫抑制中发挥着关键作用。研究数据表明，肿瘤细胞通过竞争性摄取微环境中可用的营养物质来抑制浸润淋巴细胞的功能，而这些营养物质对免疫细胞的分化和激活很重要。肿瘤细胞通过竞争性摄取葡萄糖来限制T细胞的葡萄糖消耗，从而诱导T细胞功能障碍和衰竭。此外，肿瘤中葡萄糖转运蛋白-1(GLUT1)的高表达与T细胞浸润减少有关。肿瘤细胞对营养物质的异常使用进一步导致大量代谢物的产生，从而深刻影响浸润的免疫细胞。有氧糖酵解的增加导致微环境中乳酸的积累，从而损害肿瘤靶向T细胞和NK细胞的功能。肿瘤中花生四烯酸代谢升高诱导肿瘤微环境中前列腺素E2积累，导致巨噬细胞从抑瘤M1表型向促进肿瘤M2表型再极化。代谢重编程导致的代谢物和副产物的增加也作为信号分子，有助于肿瘤中免疫抑制途径的解除。NAD代谢通过α-酮戊二酸介导的表观遗传修饰调节癌细胞中程序性细胞死亡1-配体1(PD-L1)的表达。此外，癌细胞中线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)产生的ROS引起持续的JNK激活，这与各种肿瘤中的免疫促进和免疫抑制作用有关。考虑到肿瘤代谢对免疫系统的巨大影响，已经进行了大量的研究来评估靶向肿瘤代谢中不同代谢酶的治疗潜力，从而引发对各种恶性肿瘤免疫治疗的致敏。在黑色素瘤模型中，谷氨酰胺酶抑制剂CB-839和PD-1或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)靶向治疗联合治疗可增加抗原特异性T细胞浸润并抑制肿瘤生长。精氨酸酶1抑制剂CB-1158在阻断髓细胞介导的免疫抑制方面显示出良好的治疗效果。CB-1158联合检查点阻断导致淋巴细胞浸润增强，炎症细胞因子表达增加。在过表达吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO)的肿瘤临床前模型中，阻断碳氢化合物受体通过破坏Tregs和肿瘤相关巨噬细胞介导的免疫抑制来提高免疫检查点阻断的治疗效果。临床前模型的良好结果进一步导致了许多正在进行的试验，研究代谢酶靶向治疗和免疫治疗的组合。迄今为止，还没有结合代谢酶靶向治疗和免疫治疗的联合治疗被批准用于任何类型癌症的临床治疗，可能是因为肿瘤代谢-免疫系统相互作用的复杂性以及对代谢酶非规范功能的认识不足。因此，迫切需要进一步研究免疫抑制酶的详细机制，并确定有效的代谢靶点，以便与免疫疗法联合治疗。

图文解析：

图1

要点1：

a-c.在为了探索CD73抑制与免疫治疗联合的潜在协同作用，首先在原位植入KPC细胞的小鼠中，将靶向CD73的小分子抑制剂AB680与抗PD-1 Ab联合使用。与单药治疗相比，联合治疗对肿瘤生长的抑制作用更明显，这可以通过生物发光成像信号强度和肿瘤重量来量化。此外，与其他组相比，接受联合治疗的小鼠显示出相似的体重，表明联合治疗具有良好的耐受性。使用流式细胞术进一步评估联合治疗对抗肿瘤免疫反应的潜在影响。

d.与其他组相比，联合治疗显著增加了肿瘤免疫微环境中CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞的浸润，以及IFN-γ⁺ CD4⁺ T细胞和IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞的数量。

e.此外，尽管单药治疗导致小鼠总生存期略有延长，但联合治疗方法显著改善了胰腺癌小鼠的预后。

f-h.此外，将AB680治疗与PD-1阻断联合应用于皮下植入KPC细胞的小鼠。AB680或抗PD-1 Ab单药治疗部分减缓了肿瘤进展，而联合治疗显著增加了对肿瘤生长的抑制作用，对小鼠体重没有影响。i.流式细胞分析还显示，联合治疗增加了肿瘤免疫微环境中浸润的CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、IFN-γ⁺ CD4⁺ T细胞和IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞的数量。

图2

要点2：

a-b.基于免疫标记，从27个簇中鉴定出经典的免疫细胞类型。肿瘤中浸润的B细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、DCs、双阴性(DN) T细胞、NK细胞、巨噬细胞和粒细胞的比例无显著差异。c.还评估了CD73抑制诱导的标志物表达变化。M2巨噬细胞标志物(CD206和CD163)的表达下降，但差异不显著。有趣的是，观察到耗竭T细胞标记物(PD-1、TIGIT和TIM3)和Treg标记物(Foxp3)显著降低。考虑到联合治疗诱导的抑制作用完全依赖于T细胞，在t-SNE分析的基础上进一步对CD3⁺ T细胞重新聚类。

d-e.正如预期的那样，CD73抑制导致T细胞亚群发生非常大的变化。值得注意的是，CD73抑制导致Treg细胞(CD4⁺ CD25⁺ Foxp3⁺)的浸润减少。此外，接受CD73抑制治疗的小鼠显示耗竭CD8⁺ T细胞(CD8⁺ PD-1高CD38⁺)的产生减少。此外，与对照组小鼠相比，CD73抑制组小鼠的PD-1 low T细胞(CD8⁺ PD-1low)数量增加，中枢记忆T细胞(CD62L⁺ CD44⁺)比例增加。这些数据表明，CD73靶向治疗可能导致肿瘤中Treg积累的抑制，从而进一步导致效应T细胞活化增强和耗竭T细胞的产生减少。

f-g.值得注意的是，32例胰腺癌患者样本和12例小鼠自发性胰腺癌样本的免疫组化(IHC)染色显示，肿瘤中CD73的高表达水平与Tregs的肿瘤浸润增加有关。

h.此外，免疫荧光染色显示Tregs主要聚集在胰腺癌中CD73高表达的区域。这些数据表明CD73在胰腺癌中的表达可能在调节Treg积累中起关键作用。

图3

要点3：

a-c.首先，将野生型(WT)KPC和CD73 KO KPC细胞原位植入WT C57BL/6J小鼠体内。流式细胞术和免疫组化染色显示，肿瘤细胞中CD73的缺失显著抑制Treg的积累。为了研究肿瘤免疫微环境中CD73的缺失是否对Tregs的抑制具有相同的效果，

d-f.将WT KPC细胞原位植入WT小鼠和CD73缺失的C57BL/6J小鼠。然而，流式细胞术和免疫组化染色显示，肿瘤免疫微环境中CD73的缺失并不影响Treg在胰腺癌中的积累。最后，基于Transwell模型的体外T细胞迁移实验用于评估Tregs向胰腺癌细胞的募集。

g.CD73在KPC、Panc02、SW1990和BXPC-3细胞中的过表达显著增强，而这些细胞中的CD73缺失分别抑制了Treg的迁移。将CD73缺失或未缺失的BXPC-3细胞原位植入裸鼠体内，评估Treg在体内的募集情况。裸鼠经尾静脉连续3天注射人Treg细胞。第四天切除肿瘤，进一步分析Treg浸润情况。

h.流式细胞分析显示，CD73缺失显著抑制了人Tregs向裸鼠BXPC-3肿瘤的募集。

i.为了评估肿瘤细胞自主CD73是否以Treg依赖的方式促进肿瘤进展，将WT和CD73OE KPC细胞原位植入经抗CD25 Ab或不经抗CD25 Ab处理的C57BL/6J小鼠中以消耗Treg。

j-m.有趣的是，Treg缺失显著抑制CD73过表达诱导的肿瘤进展。各组小鼠体重无统计学差异。此外，Treg缺失在很大程度上消除了CD73过表达诱导的CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞浸润和活化的抑制。这些数据表明胰腺癌细胞自主CD73通过增强Treg的募集抑制抗癌免疫并促进肿瘤进展。

图4

要点4：

a-d.由趋化因子是调节各种恶性肿瘤中Treg浸润的最关键分子之一。通过筛选众多趋化因子，发现KPC细胞中CD73的缺失导致CCL5表达下调，而Panc02细胞中CD73的过表达导致CCL5上调。先前的研究表明，肿瘤细胞分泌的CCL5导致多种癌症中treg的浸润增加。

e.此外，TCGA数据显示胰腺癌中CCL5表达与FOXP3表达呈正相关。根据以往的报道，CCL5在巨噬细胞、NK细胞、活化的CD8 T细胞、肿瘤细胞等均有表达。

f.因此，使用流式细胞术分析来评估CCL5在不同细胞群中的表达水平。结果显示，CD73的缺失只会导致肿瘤细胞中CCL5的下调，而不会导致其他细胞群的下调。进一步评估了CD73缺失或过表达的不同胰腺细胞系中CCL5表达水平的变化。在Panc02、BXPC-3、SW1990和KPC细胞中，CD73缺失导致CCL5下调，而CD73过表达诱导CCL5上调。

i-j.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，证实与相应的WT细胞相比，CD73 OE细胞中CCL5的分泌增加，CD73KD和KO细胞中CCL5的分泌减少(图4小时)。

k-l.14对临床组织样本的免疫印迹和26个肿瘤样本的免疫组化染色证实了CD73和CCL5表达呈正相关。

m.此外，在Panc02、BXPC-3、SW1990和KPC细胞中，用中和的Ab阻断CCL5在很大程度上消除了CD73过表达诱导的Treg迁移。

图5

要点5：

a.基于WT和CD73OE KPC细胞RNA-seq数据的GSEA显示，趋化因子和细胞因子受体相互作用途径显著上调，CCL5是转录上调最多的基因之一。

b.CD73缺失和过表达诱导的CCL5转录改变在KPC、BXPC-3和SW1990细胞中得到进一步证实。作为一种代谢酶，肿瘤细胞自主CD73将腺苷单磷酸(AMP)转化为腺苷(ADO)，从而进一步激活不同的腺苷受体及其下游信号级联反应。

c-f.为了研究CCL5的调节是否依赖于ADO，将CD73缺失或不缺失的KPC和BXPC-3细胞与ADO共培养。ADO处理在很大程度上挽救了CD73耗竭或抑制诱导的CCL5下调。

g-h.此外，用靶向Adora1、Adora2a、Adora2b和Adora3的抑制剂处理过表达CD73的KPC和BXPC-3细胞。用一种Adora2a抑制剂KW6002治疗，在很大程度上消除了CD73过表达诱导的CCL5上调。

i-j.此外，KW6002抑制Adora2a和消耗Adora2a在mRNA和蛋白水平上完全消除了ADO诱导的CCL5上调。这些结果表明，CD73通过将AMP转化为ADO，以自分泌方式诱导胰腺癌中CCL5的上调。

图6

要点6：

a.进行KEGG富集分析，以确定KPC细胞中受CD73过表达影响最大的途径。为了评估这些通路是否参与ADO-Adora2a信号激活诱导的CCL5转录上调，随后用腺苷孵育的KPC和BXPC-3细胞筛选相应的抑制剂。

b-d.有趣的是，p38 MAPK抑制剂SB203580在mRNA和蛋白水平上显著下调CCL5。此外，证实CD73过表达诱导p38 MAPK磷酸化，CD73缺失抑制KPC和BXPC-3细胞中p38 MAPK磷酸化。

e.此外，CD73过表达诱导的p38 MAPK磷酸化在很大程度上被KW6002抑制Adora2a所消除，这表明CD73过表达以ado-Adora2a依赖的方式诱导p38 MAPK磷酸化。

f.此外，在KPC、BXPC-3、Panc02和SW1990细胞中，由ADO处理或CD73过表达诱导的CCL5上调在很大程度上被SB203580抑制p38 MAPK所消除，这表明ADO-adora2a信号通路以p38 MAPK依赖的方式诱导CCL5上调。

g.值得注意的是，STAT1被鉴定为正相关性最高的转录因子。免疫印迹结果证实，在KPC和BXPC-3细胞中，CD73过表达诱导和CD73缺失抑制STAT1磷酸化(图6小时)。

i.为了进一步证实stat1介导的CCL5诱导，对BXPC-3和SW1990细胞进行了染色质免疫沉淀(ChIP)实验。结果表明，STAT1直接与motif 3结合，并且这种结合可以通过CD73过表达或ADO处理而增强。

j-l.此外，在BXPC-3和KPC细胞中，ADO处理可以恢复CD73缺失诱导的STAT1磷酸化抑制，并且通过KW6002抑制Adora2a可以消除ADO处理诱导的STAT1磷酸化增加。证明CD73过表达以自分泌的ado-adora2a依赖的方式诱导STAT1磷酸化增加。

m.最后，CD73过表达诱导的CCL5上调被STAT1缺失完全消除。在SW1990细胞系上重复了之前的实验。这些数据表明肿瘤细胞自分泌腺苷通过Adora2a-p38-STAT1途径上调CCL5的分泌。

图7

要点7：

a-d.为了研究CCL5在体内的治疗潜力，并确定CD73诱导的Treg浸润是否与ADO积累无关，将WT和CD73OE KPC细胞原位植入有或没有CCL5阻断的C57BL/6J小鼠体内。有趣的是，CCL5阻断显著抑制CD73过表达诱导的肿瘤进展。两组小鼠体重没有差异。

e.在接受或不接受CCL5阻断治疗的两组之间，ADO在肿瘤中的积累没有显著差异。此外，

f-h.CCL5阻断处理在很大程度上消除了CD73过表达诱导的Tregs浸润，以及对CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞浸润和活化的抑制。i.此外，虽然在CCR5⁺CD8⁺T细胞群体中没有观察到显著差异，但CD73过表达诱导CCR5⁺Treg群体显著增加，这在很大程度上被CCL5阻断治疗所消除。

j.此外，将WT和CD73 KO KPC细胞皮下接种到C57BL/6J小鼠体内，瘤内注射CCL5或不注射CCL5。

k-n.有趣的是，注射CCL5后，CD73消耗诱导的肿瘤生长抑制在很大程度上被消除。各组小鼠体重没有差异。在肿瘤内注射CCL5或不注射CCL5的两组之间，ADO在肿瘤中的积累没有显著差异。

o-q.此外，CCL5注射在很大程度上消除了CD73消耗诱导的Treg抑制以及CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞的浸润和活化。

r.此外，尽管CCR5⁺CD8⁺T细胞群体中没有观察到显著差异，但CD73消耗诱导的CCR5⁺Treg群体中存在显著抑制，CCL5注射后这种抑制基本被消除。

本文小结：

综上所述，研究证明CD73在胰腺癌免疫抑制中的兼职功能，以癌症代谢、免疫微环境和免疫治疗耐药之间复杂串扰为特征的理想模型。研究发现肿瘤细胞自主CD73可促进Treg募集，其中通过综合蛋白质组学和转录组学分析，CCL5被确定为CD73的重要下游效应子。CD73通过肿瘤细胞自分泌腺苷-Adora2a信号介导的p38-STAT1轴激活转录上调CCL5，将Tregs募集到胰腺肿瘤并造成免疫抑制微环境。研究强调CD73-腺苷代谢以肿瘤自主和自分泌的方式转录控制胰腺癌免疫抑制。

参考文献：

Tang, T., Huang, X., Lu, M. et al. Transcriptional control of pancreatic cancer immunosuppression by metabolic enzyme CD73 in a tumor-autonomous and -autocrine manner. Nat Commun 14, 3364 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38578-3