IF16.2 Cancer communications │靶向组蛋白去乙酰化酶通过诱导mettl14修饰的m6A RNA甲基化抑制眼部黑色素瘤的肿瘤生长前言： 2023年7月19日，上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科的范先群教授团队在Cancer communications上发表了题为“Targeting histone deacetylase suppresses tumor growth through eliciting METTL14-modified m6A RNA methylation in ocular melanoma”的研究论文，结果表明，HDACis通过协调m6A修饰发挥抗癌作用，这揭示了眼部黑色素瘤中HDAC/METTL14/FAT4表观遗传级联的"组蛋白-RNA串扰"。
背景介绍： 组蛋白乙酰化是基因调控的重要表观遗传标记。组蛋白乙酰化具有多样性和高度动态性，控制转录，在生物过程中不可或缺，包括DNA修复、RNA剪接和干性维持。此外，组蛋白乙酰化稳态的失调导致了不同的发病机制，特别是在癌症中。N6甲基腺嘌呤(m6A)RNA修饰是最常见的信使RNA修饰，在RNA代谢调控中发挥重要作用，包括RNA加工、核输出、RNA翻译和衰变。迄今为止，m6ARNA修饰稳态的丧失被认为是多种癌症的重要触发因素，包括白血病、乳腺癌和黑色素瘤。本研究旨在探讨组蛋白乙酰化和m6A修饰在眼部黑色素瘤发生中的调控作用。 图文解析：
图1 要点1： A-B.为了探索这些表观遗传学药物的临床潜力，研究人员使用245种表观遗传学药物进行了高通量抑制剂库筛选。第一轮筛选显示，包括4个HDACis在内的6个抑制剂在眼部黑色素瘤细胞系(92.1和CRMM1)中触发了>60%的抑制效率，而在正常黑色素细胞中的抑制效率<30%。 C.在第二轮验证中，研究人员比较了每种抑制剂在眼部黑色素瘤细胞系和正常黑色素细胞中的IC50。三个HDACis，LBH589，RG2833和LMK-235，表现出肿瘤选择性抑制，选择性指数>5。 D-E.由于LBH589是HDACi家族的重要成员，研究人员检测了LBH589处理后眼部黑色素瘤细胞中的全局组蛋白乙酰化水平。组蛋白乙酰化标志物(H3K27Ac和H3K9Ac)的水平在3种眼部黑色素瘤细胞系中均显著升高。 F-G.值得注意的是，100nmol/LLBH589诱导了饱和的组蛋白乙酰化水平；因此，本研究选择100nmol/L作为LBH589的工作浓度。研究人员发现100nmol/L LBH589处理后，眼部黑色素瘤细胞的集落形成能力明显受损。 H.为了验证LBH589诱导的抑制在体内的作用，研究人员用带有荧光素酶标签的92.1细胞建立了眼部原位黑色素瘤移植瘤模型。动物成像显示，与对照组相比，LBH589处理组的生物发光强度和肿瘤体积均降低。这些发现表明LBH589在体外和体外均选择性抑制眼部黑色素瘤的恶性行为。
图2 要点2： A.为了探究LBH589的下游作用靶点，研究人员对LBH589处理92.1细胞后进行了高通量转录组分析。 B.RNA-seq数据显示出剧烈的转录变化，其中2，841个基因上调，2，086个基因下调。值得注意的是，这些下调的基因主要富集在细胞周期、细胞分裂和DNA复制过程中，这支持了在眼部黑色素瘤中观察到的LBH589诱导的抑制表型。 C.令人惊讶的是，研究人员观察到大多数上调基因(1776/2841,62.5%)具有不同的m6A甲基化水平(meRIP-seq和miCLIP-seq数据,GSE137675)，表明HDAC抑制可能调节全局m6A甲基化模式。 D.研究人员使用斑点杂交方法检测了全局m6A甲基化水平。研究人员观察到黑色素瘤细胞中的m6A甲基化水平比正常黑色素细胞中的低，这与黑色素瘤中的其他m6A发现一致。E.更重要的是，研究人员发现用LBH589处理眼部黑色素瘤细胞后，总的m6A甲基化水平比在皮肤黑色素瘤细胞中升高。这些发现表明，抑制HDAC可以恢复眼部黑色素瘤中的m6A甲基化水平。 F.研究人员随后探讨了LBH589诱导m6A甲基化激活的分子机制。他们列出了m6A相关修饰酶的RNA-seq数据，包括写入蛋白(METTL3、METTL14、WTAP)、擦除蛋白(ALKBH5和FTO)和读出蛋白(YTHDF1-3)。 G-H.结果表明，METTL14在LBH589处理的黑色素瘤细胞中显著增加；然而，其他与m6A相关的修饰酶保持不变。综上所述，这些数据表明，在眼部黑色素瘤中，HDAC抑制诱导METTL14的显著上调，从而导致全局m6A甲基化水平的激活。
图3 要点3： A.由于HDACis在组蛋白乙酰化调控中发挥重要作用，研究人员通过高通量H3K27Ac(GSE214464)和H3K9Ac(GSE162573)CUT&Tag来确定眼部黑色素瘤细胞中组蛋白乙酰化模式。值得注意的是，H3K27Ac和H3K9Ac CUT&Tag显示METTL14启动子在眼部黑色素瘤中是低乙酰化的。 B.随后，Ch IP实验证实，与正常色素细胞相比，眼黑色素瘤细胞中METTL14启动子的H3K27Ac和H3K9Ac强度降低。 C.最重要的是，HDAC抑制进一步增加了眼部黑色素瘤细胞中METTL14的H3K27Ac和H3K9Ac水平。总之，这些发现表明METTL14在眼部黑色素瘤中是低乙酰化的，并且可以通过抑制HDAC来挽救。 D.研究人员使用组织芯片检测了METTL14在患者队列中的表达水平，其中包括56个眼部黑色素瘤样本和27个健康人黑色素细胞痣样本。与正常色素痣相比，眼黑色素瘤中METTL14表达下调。 E.葡萄膜黑色素瘤单细胞测序(GSE139829)数据显示，METTL14表达与多种致癌途径负相关，包括侵袭(R=-0.41,P<0.001)、转移(R=-0.39,P<0.001)、上皮-间质转化(EMT)(R=-0.27,P<0.001)、炎症(R=-0.25,P<0.001)、增殖(R=-0.20,P<0.001)和细胞周期(R=-0.10,P<0.001)。 F.最重要的是，在他们的队列(log-rank P=0.011)中，METTL14表达升高与复发率降低有关。此外，在眼部黑色素瘤细胞系中，METTL14的表达在RNA和蛋白水平均降低。综上所述，这些数据表明METTL14在眼部黑色素瘤中作为一个重要的肿瘤抑制因子。 G-H.为了探究METTL14在LBH589介导的肿瘤抑制中的作用，研究人员沉默了METTL14，然后用LBH589处理眼部黑色素瘤细胞。研究人员观察到沉默METTL14后，LBH589诱导的METTL14活化在RNA和蛋白表达水平上都受到了抑制。I-J.敲低METTL14后，LBH589介导的肿瘤抑制程度部分降低，包括克隆形成和迁移。 K.更重要的是，靶向沉默METTL14也部分恢复了LBH589处理的原位移植瘤的恶性生长。综上所述，这些发现表明METTL14沉默的细胞对HDAC抑制的抵抗能力更强。
图4 要点4： A.研究人员随后探讨了METTL14在眼部黑色素瘤中发挥抑癌作用的机制。利用多组学整合分析，研究人员鉴定了3个基因(CRYBG3、FAT4、SEMA3D)，满足以下标准：METTL14过表达(蓝色圆圈,GSE215095)和LBH589处理(棕色圆圈,GSE214457)后上调，在TCGA队列(红圈,R>0.3,P<0.05)中与METTL14正相关，在m6A修饰水平较低的肿瘤(绿圈,GSE176345)中下调(黄色圆圈,GSE137675)。 B-C.值得注意的是，在这3个基因中，只有FAT4在TCGA队列(R=0.471,P<0.001)中表现出与METTL14平行表达的预后价值。 D-E.值得注意的是，RNA-seq图谱显示，METTL14过表达和LBH589处理后，FAT4表达显著增加。 F-G.更重要的是，研究人员发现FAT4的表达受到LBH589处理的诱导，并且在RNA和蛋白质水平上都与METTL14的表达相关。综上所述，这些数据表明FAT4可能参与METTL14介导的眼部黑色素瘤的肿瘤抑制。
图5 要点5： A-B.研究人员检测了FAT4在眼部黑色素瘤样本和细胞系中的表达情况。与METTL14类似，FAT4水平在眼部黑色素瘤临床样本中显著降低，这与复发率降低有关。 C-E.重要的是，在眼部黑色素瘤细胞系中，FAT4的RNA和蛋白水平也降低。 F.为了评估FAT4在METTL14介导的肿瘤抑制中的作用，研究人员在METTL14过表达的眼部黑色素瘤细胞系中沉默FAT4的表达。 G-H.有趣的是，敲低FAT4减弱了METTL14介导的肿瘤抑制作用，包括克隆形成能力和转移能力。 I.同样，在原位移植瘤模型中，FAT4的沉默抵消了METTL14过表达诱导的肿瘤抑制作用。综上所述，这些结果表明FAT4参与眼部黑色素瘤中METTL14介导的抑制网络。
图6 要点6： A-B.与METTL14在这些细胞中低水平表达的事实一致，研究人员使用miCLIP-seq和meRIP-seq发现FAT4在眼部黑色素瘤细胞系中低甲基化。 C.利用RIP-PCR技术，研究人员发现在正常黑素细胞和METTL14过表达的眼黑素瘤细胞中，FAT4 mRNA均与YTHDF1特异性结合，而其他阅读蛋白(YTHDF2和3)与FAT4mRNA之间存在微弱的相互作用信号。 D.因此，沉默YTHDF1显著抑制FAT4的表达，而在YTHDF2/3沉默的细胞中，FAT4的表达保持不变。 E.有趣的是，外源性表达METTL14增加了FAT4 mRNA的稳定性，这与METTL14过表达细胞(紫色)中FAT4表达升高有关。此外，沉默YTHDF1显著降低了FAT4 RNA稳定性(褐色)，并消除了METTL14介导的功能(绿色)。 F-G.有趣的是，FAT4和YTHDF1(R=0.359,P<0.001)之间存在显著的正相关。这些发现表明YTHDF1促进FAT4的表达依赖于METTL14介导的m6A修饰。
图7 要点7： 在这项研究中，研究人员揭示了METTL14/FAT4信号级联在眼部黑色素瘤中对肿瘤抑制的重要性。总的来说，在眼部黑色素瘤中，HDACis部分恢复了METTL14的组蛋白乙酰化水平，从而诱导了FAT4介导的肿瘤抑制信号通路。因此，"靶向m6A重编程策略"为探索肿瘤发生过程中的表观基因组动态提供了一条途径。 本文小结： 综上所述，研究人员的研究揭示了组蛋白乙酰化是眼部黑色素瘤中m6A甲基化的重要调节因子。LBH589抑制HDACs并激活METTL14的组蛋白乙酰化，进而介导肿瘤发生中的m6A修饰。此外，METTL14通过m6A-YTHDF1依赖的方式促进肿瘤抑制因子FAT4的表达，从而发挥抑癌作用。这些结果揭示了HDACi LBH589通过重编程m6A甲基化抑制癌症进展的机制，揭示了眼部黑色素瘤发生过程中一种新的组蛋白-RNA串扰表观遗传机制。 参考文献： Zhuang, A., Gu, X., Ge, T., Wang, S., Ge, S., Chai, P., Jia, R., & Fan, X. (2023). Targeting histone deacetylase suppresses tumor growth through eliciting METTL14-modified m6 A RNA methylation in ocular melanoma. Cancer communications (London, England), 10.1002/cac2.12471. Advance online publication. https://doi.org/10.1002/cac2.12471 |
