IF 10.787 Redox Biology│内皮细胞中RNA结合蛋白GIGYF2的异常高表达调节血管衰老和功能前言： 2023年7月24日，西北大学生命科学与医学院熊裕焱教授团队在Redox Biology发表题为“Aberrant hyper-expression of the RNA binding protein GIGYF2 in endothelial cells modulates vascular aging and function”的研究论文。研究揭示了GIGYF2作为RBP增强了STAU1的mRNA稳定性，STAU1通过与其内含子区域结合上调LAMTOR4表达，通过将mTORC1募集到溶酶体膜来激活mTORC1-S6K1信号传导，最终导致EC衰老、功能障碍、和血管老化。破坏GIGYF2-STAU1-mTORC1信号级联可能是对抗血管衰老和衰老相关心血管疾病的一种有前景的治疗方法。
背景介绍： 心血管疾病（CVD）是全球死亡和发病率最高的主要原因。随着生活方式的改变和人口老龄化，CVD的患病率呈上升趋势，给社会带来沉重的经济负担。内皮细胞（EC）衰老被认为是CVD发病机制的主要风险因素。血管内皮细胞是位于血管内腔表面的一层扁平鳞状上皮细胞，不仅起到血液与血管壁/组织之间的保护屏障作用，还合成和释放多种血管活性物质，以调节血管功能和维持血管稳态。衰老的EC以引起内皮功能障碍，表现为一系列分子变化，如增加的活性氧（ROS）产生，减少的NO生成，增强的细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）分泌和促炎细胞因子，这些是CVDs发病和发展的常见病理触发因子。大量的基础和临床证据表明，ECs中内皮一氧化氮合酶（eNOS）解耦会导致NO生物可用性降低和氧化应激增加，从而引起或加重内皮功能障碍和血管衰老。许多当前的基因组广泛筛选和连锁分析表明，GIGYF2是与衰老相关的疾病帕金森病（PD）的候选基因。此外，GIGYF2的异常表达可能通过负调控IGF1R信号通路，促进与衰老相关的疾病和与糖尿病相关的认知障碍的发生。这些研究揭示了GIGYF2的一种新机制，该机制通过上调staufen双链RNA结合蛋白1(STAU1)来导致EC衰老、功能障碍和炎症，STAU1激活晚期内体/溶酶体接头MAPK和mTOR激活剂4(LAMTOR4)-mTORC1-S6K1信号轴通过将mTORC1募集至溶酶体膜。这项研究为治疗血管衰老和衰老相关的心血管疾病提供了一个有前景的治疗靶点。 图文解析：
图1 要点1： A-B.研究人员通过介导GIGYF2靶向lentivirus shRNA在衰老的HUVECs中去除GIGYF2，并通过免疫印迹和qRT-PCR进行验证。 C-F.在GIGYF2去除的衰老的HUVECs中，研究人员观察到GIGYF2去除显著减少了SA-β-gal阳性细胞的数量，p21和p16 mRNA表达和ROS产生，反之增强了SIRT1和SIRT6 mRNA的表达和NO产生。 G-H.此外，在GIGYF2敲除的衰老的HUVECs降低了细胞因子IL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA水平以及黏附分子ICAM-1和VCAM-1的mRNA水平，并抑制了THP-1单核细胞对内皮细胞的黏附。 I.此外，PCNA免疫染色显示，在衰老的HUVECs中沉默GIGYF2也可以防止细胞增殖的减少，证明了GIGYF2在ECs衰老、内皮功能障碍和炎症中的因果作用。
图2 要点2： 为了进一步确认GIGYF2在促进血管内皮细胞衰老和内皮功能障碍中的作用，研究人员在年轻的ECs中过表达了GIGYF2。 A-F.通过免疫印迹和qRT-PCR验证，GIGYF2过表达显著增加了SA-β-gal阳性细胞的数量，p21和p16 mRNA的表达，降低了SIRT1和SIRT6 mRNA的表达，以及eNOS解耦，即降低的NO水平和细胞内ROS的增加。在eNOS抑制剂L-NAME（1mM，1h）处理后，GIGYF2诱导的eNOS解耦可以被消除。 G-I.GIGYF2在年轻内皮细胞中的过表达显著增强了IL-6、TNF-α、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达水平，以及单核细胞对内皮细胞的黏附，同时显著降低了细胞的增殖能力。这些结果提供了确凿的证据，证明GIGYF2在促进ECs衰老、功能障碍和炎症方面发挥了明确的作用。大量的研究已经确定mTORC1信号与细胞衰老密切相关，介导了有机体的衰老，这促使研究人员研究GIGYF2是否通过激活mTORC1-S6K1信号轴介导ECs衰老。 J.事实上，在年轻的HUVECs中过表达GIGYF2显著增强了mTORC1下游底物S6K1（S6K1-T389）和S6蛋白（S6-S235/236）的磷酸化表达水平，通过免疫印迹得到确认。 K.相反，在衰老的HUVECs中，沉默GIGYF2显著降低了S6K1-T389和S6-S235/236的表达水平。此外，在HEK 293T细胞系中也观察到类似的结果。综上所述，这些结果提示研究人员推测，GIGYF2调节mTORC1-S6K1信号轴可能调控ECs的衰老、功能障碍和炎症。
图3 要点3： 为了验证上述推测，研究人员检查了mTORC1抑制剂雷帕霉素（RAPA）对GIGYF2诱导的年轻内皮细胞衰老、功能障碍和炎症的影响。 A.通过免疫印迹确认，RAPA显著抑制了GIGYF2诱导的mTORC1-S6K1激活。 B,C.同时，研究人员观察到RAPA处理阻断了GIGYF2在年轻细胞中引发的细胞衰老，这表现为降低的SA-β-gal阳性细胞数量和p21和p16 mRNA的表达，以及增强的SIRT1和SIRT6 mRNA的表达。 D-G.此外，GIGYF2过表达引起的eNOS解耦和促炎反应，即细胞内ROS产生增加，NO产生减少，IL-6、TNF-α、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的mRNA表达水平增加，以及THP1单核细胞对内皮细胞的黏附增加，都被RAPA阻断。 H.GIGYF2过表达导致细胞增殖停滞，这也被RAPA消除。因此，这些结果表明，GIGYF2通过触发mTORC1-S6K1信号通路促进了eNOS解耦、细胞衰老、功能障碍和炎症。
图4 要点4： 研究人员推测，GIGYF2通过上调STAU1诱导mTORC1-S6K1信号通路的激活，从而调控内皮细胞的衰老和功能障碍。接下来，为了验证研究人员的假设，研究人员在GIGYF2过表达的年轻HUVECs中进行了通过慢病毒介导的STAU1沉默。 A.如图所示，GIGYF2诱导的S6K1-T389和S6-S235/236的增加被STAU1敲除所阻断。 B-H.与此同时，GIGYF2过表达促进的内皮细胞衰老、衰老引起的功能障碍和炎症，即SA-β-gal阳性细胞数量增加，p21和p16 mRNA表达增加、细胞内ROS产生增加，SIRT1和SIRT6 mRNA表达减少、NO产生减少，IL-6、TNF-α、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达水平增加，单核细胞对内皮细胞的黏附增加，以及年轻HUVECs中PCNA阳性染色减少，也都被STAU1沉默所减轻。值得注意的是，与年轻HUVECs相比，研究人员观察到衰老的HUVECs中STAU1的mRNA和蛋白表达均上调。此外，沉默GIGYF2显著降低了衰老的HUVECs中S6K1-T389和S6-S235/236的表达水平，这可以通过STAU1过表达恢复。此外，过表达STAU1消除了沉默GIGYF2减轻HUVECs衰老、eNOS解耦、IL-6、TNF-α、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的mRNA表达水平以及单核细胞对内皮细胞的黏附的保护作用，并增强了通过PCNA阳性染色评估的细胞增殖能力。综上所述，这些数据提供了坚实的证据，支持研究人员上述的假设，即GIGYF2-STAU1-mTORC1信号通路对内皮细胞的衰老、功能障碍和炎症起到了贡献。
图5 要点5： 接下来，研究人员探究了STAU1如何激活mTORC1。Ragulator复合物在将Rag GTPase锚定到溶酶体表面以激活mTORC1通路中起着至关重要的作用。由晚期内体/溶酶体适配蛋白和MAPK和MTOR激活因子4（LAMTOR4）基因编码的蛋白作为新的Ragulator组分对mTORC1的激活至关重要。 A.在这里，研究人员发现STAU1沉默会降低衰老的HUVECs中LAMTOR4 mRNA的表达。 B.考虑到STAU1也是一个已经报道能够结合基因RNA以调控基因表达的RBP，研究人员进行了RIP实验以使用STAU1抗体沉淀LAMTOR4 mRNA，结果证实STAU1作为RBP可以结合到LAMTOR4 mRNA上。 C,D.POSTAR3数据库显示STAU1有三个潜在的结合位点，以及三个与LAMTOR4内含子区域相对应的结合位点和序列。因此，研究人员推测STAU1与LAMTOR4内含子区域的结合增强了LAMTOR4的表达，进而引起mTORC1的激活。 E.荧光素酶报告实验证实了这一推测，LAMTOR4内含子的WT1区域（chr7:100151697-100151717区域）能够与STAU1蛋白结合，而WT1-MUT、WT2区域（chr7:100152017-100152037）和WT3区域（chr7:100152437-100152457）则不能。 F.此外，免疫印迹实验证明LAMTOR4沉默可以保护免受GIGYF2过表达引起的mTORC1-S6K1激活的影响。 G.与免疫荧光染色结果一致，研究人员还发现GIGYF2的过表达显著促进了mTORC1向溶酶体（LAMP1）的转位，而这可以通过沉默LAMTOR4来阻断。这些结果表明，GIGYF2-STAU1信号通路通过上调LAMTOR4的表达，促进mTORC1向溶酶体的转位，从而驱动mTORC1-S6K1通路的激活。
图6 要点6： 大量的研究表明，内皮细胞衰老与与衰老相关的血管功能障碍密切相关，因此研究人员进一步研究了GIGYF2介导的内皮细胞衰老是否对体内与衰老相关的血管衰老和功能障碍有贡献。 A.在这里，研究人员通过将GIGYF2flox/flox小鼠与在内皮细胞特异性Cdh5启动子的控制下表达Cre的转基因小鼠交配，建立了血管内皮GIGYF2特异性敲除小鼠。 B.通过从尾部组织中的基因组DNA进行PCR基因分型筛选和验证，鉴定了纯合子内皮GIGYF2特异性敲除（GIGYF2flox/flox Cdh-Cre+）小鼠。 C.共免疫荧光染色验证了与年轻小鼠相比，老年小鼠主动脉内皮细胞中GIGYF2表达的显著上调，并且验证了GIGYF2在GIGYF2flox/flox Cdh-Cre+小鼠主动脉内皮细胞中的高效敲除。 D.此外，与年轻WT小鼠相比，研究人员观察到老年WT小鼠主动脉中GIGYF2、STAU1、S6-S235/236和S6K1-T389蛋白表达水平显著上调，而这在老年GIGYF2flox/flox Cdh-Cre+小鼠主动脉中则相反。此外，老年GIGYF2flox/flox Cdh-Cre+小鼠主动脉中抑制了与衰老相关的GIGYF2、STAU1、p21和p16 mRNA表达水平的增加，以及SIRT1和SIRT6 mRNA表达水平的降低。 E-F.进一步，表面荧光共聚焦显微镜证实老年WT小鼠中ROS产生的增加和NO生成的降低也在老年GIGYF2flox/flox Cdh-Cre+小鼠中得到抑制。为了进一步评估内皮GIGYF2基因缺失对血管内皮功能的影响，研究人员分离小鼠主动脉进行体外功能测定。 G.与年轻WT小鼠相比，老年WT小鼠对乙酰胆碱（Ach）的内皮依赖性松弛在受到血管收缩剂KCl或苯肾上腺素刺激后明显受损。值得注意的是，老年GIGYF2flox/flox Cdh-Cre+小鼠对Ach的内皮依赖性松弛显示了显著改善。 H.然而，在内皮GIGYF2缺失的老年小鼠中，对NO供体SNP的内皮非依赖性松弛并未受到影响。随着年龄的增长，动脉往往变得更加僵硬，脉搏波速度（PWV）升高，这可能会导致血压升高。与年轻WT动物（Young-WT）相比，研究人员观察到老年小鼠（Old-WT）的PWV、收缩压和舒张压显著升高。值得注意的是，内皮特异性GIGYF2敲除（Old-GIGYF2flox/flox Cdh-Cre+）显著抑制了与年龄相关的PWV增加，而对血压没有影响。 本文小结： 综上所述，研究数据揭示了GIGYF2作为RBP通过上调STAU1促进内皮细胞衰老、功能障碍和炎症，STAU1激活原代内皮细胞中的LAMTOR4-mTORC1-S6K1信号级联，从而导致血管功能障碍和炎症、老化。这些发现为GIGYF2-STAU1-mTORC1信号轴作为治疗衰老相关心血管疾病的潜在治疗靶点提供了见解。这项研究为治疗血管衰老和衰老相关的心血管疾病提供了一个有前景的治疗靶点。 参考文献： Niu F, Li Z, Ren Y, et al. Aberrant hyper-expression of the RNA binding protein GIGYF2 in endothelial cells modulates vascular aging and function[J]. Redox Biology, 2023: 102824. https://doi.org/10.1016/j.redox.2023.102824 |
