IF 69.504 Nature│RBFOX2调节胰腺癌中选择性剪接的转移特征前言： 2023年3月22日，来自以色列希伯来大学哈大沙医学院的Rotem Karni研究团队在Nature上发表题为“RBFOX2 modulates a metastatic signature of alternative splicing in pancreatic cancer”的研究论文，研究发现差异剪接事件与PDA进展程度相关，并鉴定到剪接因子RBFOX2参与其中，过表达RBFOX2可以降低癌细胞转移能力，而敲除RBFOX2可以增强癌细胞转移能力，说明RBFOX2是一个PDA的转移抑制因子，并发现RBFOX2的靶基因参与RHO GTPase通路，调控细胞骨架组装和粘着斑形成，且RBFOX2的靶基因MPRIP与PDA转移相关。
背景介绍： 胰腺导管腺癌(PDA)具有侵袭性局部侵袭和转移扩散的特点，致死率高。虽然PDA进展过程中的驱动基因突变是保守的，但没有特定的突变与转移灶的播散相关。胰腺癌基因组分析揭示了四个核心PDA驱动基因:KRAS、SMAD4、CDKN2A和TP53。试图根据基因表达谱分析PDA的研究将PDA分为两种、三种或四种亚型，并表明这些亚型可能是预后和治疗反应的预测因子。尽管如此，这些驱动基因突变及其表达水平在PDA进展过程中是保守的，但尚未发现与转移进展相关的突变。关于选择性剪接和剪接因子在PDA中的作用的报道很少。 图文解析：
图1 要点1： a-c.基于临床和/或病理信息的集群注释显示，这两个集群与肿瘤部位相关良好；61%的原发性胰腺肿瘤属于第一类，71%的转移性肿瘤样本属于第二类。此外，集群2(转移组)中90%的转移样本被注释为晚期IV期，集群1(原发性组)中96%的转移样本被注释为IB(5.9%)，IIA(13.9%)，IIB(70.2%)或III(5.96%)期。大量与转移组聚集在一起的原发性肿瘤样本被确定为晚期IV期。相反，一些转移样本与原发性肿瘤组聚集在一起。一种可能的解释是微环境中的非恶性细胞污染了转移性样本。由于大多数转移样本为肝转移，无法根据肿瘤位置(肝、肺、腹水或心脏)对转移组进行亚聚类。基于基因表达的PCA没有检测到相同的聚类模式。因此，该分析支持剪接改变与PDA进展相关的假设。关注原发组和转移组之间最强大的差异剪接事件，使用被正确注释为原发或转移肿瘤的样本进行进一步分析。 d.前20个剪接事件足以将PDA患者样本分为与临床阶段高度相关的两组。然而，这种基于这些基因表达的聚类并没有产生不同的组。 e.接下来，使用XSTREME工具对这些事件进行了无偏从头基序分析。鉴定出的两个重要基序与RBFOX2的一级和二级剪接因子结合序列GCAUG、GCCUG或GCUUG相似。对显著差异剪接事件的Reactome通路富集分析显示，RHO GTPase通路中的基因富集。它参与细胞骨架组织和迁移。 f.然后，对RHO通路基因中的差异剪接事件进行了无偏从头基序分析。这些事件的5'剪接位点上游最丰富的基序与RBFOX2结合序列具有高度的同源性。分析的差异剪接基因与已知RBFOX2靶基因的比较发现了274个常见基因。随着RHO GTPase通路中基因的富集。最近的一项研究表明，规范的RBFOX2基序在调节细胞骨架组织的基因中富集。这些结果提示RBFOX2介导的剪接可能通过细胞骨架变化调节转移过程的可能机制。
图2 要点2： a.研究RBFOX2是否直接影响PDA细胞的转移能力。用表达RBFOX2的逆转录病毒转导PDX衍生的转移细胞X50和X139。 b-c.RBFOX2过表达大大降低了这些细胞的转移潜能，与对照细胞相比，它们在伤口愈合实验中迁移减少，集落形成受到抑制，而不影响增殖。 d.为了测试RBFOX2对体内侵袭的影响，将经RBFOX2 cDNA转导的mCherry标记的X50 PDX细胞静脉注射到NOD-SCID小鼠体内。观察到，与注射对照细胞的小鼠相比，肺转移瘤的数量大幅减少。 e-f.使用两种不同的CRISPR引导RNA敲除RBFOX2可显著提高BxPC3原代PDA细胞和原代PDX衍生细胞系(X252)的集落形成和迁移率。同样，没有检测到对增殖的影响。 g-i.将GFP标记的RBFOX2缺失的BxPC3原代PDA细胞静脉注射到NOD-SCID小鼠中，发现与对照细胞相比，肺转移数量增加，肿瘤体积显著增加。 j-n.RBFOX2蛋白含有一个RNA识别基序(RRM)，该基序识别公认序列GCAUG。为了确定RBFOX2的剪接调节活性是否与其对转移性PDA的作用有关，尝试利用RRM缺失的RBFOX2 cDNA (RBFOX2ΔRRM)拯救表达RBFOX2 EIJ sgRNA的X50转移性PDA细胞和BxPC3原代PDA细胞的表型。在两种细胞系中，RBFOX2ΔRRM的表达均未减弱表型，这表明RBFOX2的RRM对于其在PDA进展中的肿瘤抑制活性至关重要。
图3 要点3： a-b.为了确定调控PDA细胞转移过程的基本RBFOX2剪接靶点，确定了114个RBFOX2依赖性的可选剪接事件，这些事件在每次比较中相互调节，P值小于0.05，且|ΔPSI|大于10%。对这114个可选剪接事件的分析显示，这一组中主要的可选剪接事件类型是单外显子跳变(45%);备选5'剪接位点(14%)、备选3'剪接位点(16%)、互斥外显子(7%)、多外显子跳变(9%)和内含子保留(9%)。 c.对87个RBFOX2调控基因的反应组分析显示，RHO GTPase(RHOA，CDC42和RAC1)通路。 d.RHO GTPase通路中的基因也在患者样本与合并基因之间的重叠以及已知RBFOX2靶点与合并基因之间的重叠中富集。这些通路是众所周知的肌动蛋白细胞骨架、细胞极性、微管动力学和囊泡运输的调节因子。支持RBFOX2在PDA中作为转移性肿瘤抑制因子的生物学作用。RBFOX2 mRNA的半衰期在转移性肿瘤细胞系和原发肿瘤细胞系中相似，而RBFOX2蛋白的半衰期在转移性X50细胞中较短，表明蛋白降解增强。研究结果表明，RBFOX2在PDA的转移过程中具有肿瘤抑制作用。 e-f.为了研究RBFOX2对RHO GTPase通路的调控是否对胰腺癌进展至关重要，利用了RHO GTPase通路的两种抑制剂:MBQ167(一种RAC/CDC42双抑制剂)和硫唑嘌呤(一种RAC1活性和RAS超家族GTPase的阻断剂)。MBQ167给药于RBFOX2缺失的BxPC3细胞抑制了迁移率，但体外存活或增殖率没有变化。 g-h.在体内给小鼠静脉注射GFP标记的RBFOX2缺失的BxPC3细胞或GFP标记的PDX来源的转移性X50细胞，MBQ167抑制肺转移，对皮下原发性肿瘤生长没有影响。
图4 要点4： a-b.BFOX2的过表达诱导MPRIP的外显子的包含，而RBFOX2敲除诱导了该外显子的跳过。 c.与原发肿瘤相比，转移性PDA样本(较低PSI)中跳过MPRIP异构体的数量更高。 d.基于中位PSI值，低MPRIP组患者的生存结果更差(比高PSI组患者短52.34个月)。这些结果支持这种MPRIP剪接事件在PDA进展中的临床相关性。 e.预测跳过的MPRIP异构体将与PDA进展中的致癌活性有关。接下来，测试了MPRIP剪接的调节是否会影响PDA肿瘤细胞系的转移潜能。为了诱导MPRIP外显子23的跳跃，针对外显子23的3'或5'剪接位点设计了CRISPR sgRNA。这两种sgRNA都触发了23号外显子的有效跳过。 f-g.与对照细胞相比，表达这些sgRNAs的BxPC3原发肿瘤细胞在软琼脂中的迁移能力和集落形成能力增强，但对增殖率没有影响。 h.将GFP标记的具有3'或5'剪接位点sgRNAs的BxPC3原发肿瘤细胞静脉注射到NOD-SCID小鼠体内，与对照细胞相比，肺转移灶的数量显著增加。 i.为了使MPRIP在转移细胞中包含23号外显子，设计了一种sgRNA，破坏位于24号外显子3'未翻译区域的RBFOX2基序(GCAUG)。基于CRISPR的突变中断RBFOX2基序增加了外显子23的包含。 j-l.X50转移细胞携带靶向RBFOX2基元的sgRNA(DS-24 MPRIP sgRNA)，其在软琼脂中的迁移能力明显减慢，集落形成减少，但不影响增殖率。为了研究MPRIP剪接调节在体内的作用，我们将gfp标记的表达CRISPR对照或DS-24 MPRIP sgRNA的X50转移细胞静脉注射到NOD-SCID小鼠体内。值得注意的是，在转移性X50细胞中包含MPRIP外显子抑制了体内的转移潜能。 本文小结： 综上所述，研究发现剪接因子RBFOX2在PDA中作为转移抑制因子的作用，并在转移性PDA中发现了RBFOX2调节的替代剪接特征。在RBFOX2调控的剪接靶点中检测到了RHO GTPase途径基因的富集，并证实了它们在胰腺癌细胞侵袭中的功能作用。对RHO-RAC通路的药理学或对这些通路中选择性剪接事件的精确调节可以改变致癌与肿瘤抑制亚型的平衡，并且可能具有作为PDA治疗靶点的潜力。 参考文献： Jbara, A., Lin, KT., Stossel, C. et al. RBFOX2 modulates a metastatic signature of alternative splicing in pancreatic cancer. Nature 617, 147–153 (2023). 网址：https://doi.org/10.1038/s41586-023-05820-3 |
