搜索
全国服务热线 020-31100174



IF 38.104 STTT│高密度脂蛋白通过长链非编码RNA HDRACA调控血管生成

前言:

2023年8月14日,中山大学区景松及欧志君共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy在线发表了题为“High-density lipoprotein regulates angiogenesis by long non-coding RNA HDRACA”的研究论文,该研究揭示高密度脂蛋白通过长非编码RNA HDRACA调节血管生成。该研究鉴定了一种长的非编码RNA HDACA,它参与HDL对血管生成的调节。在本研究中,研究者发现nHDL通过激活含有WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2来下调HDACA在内皮细胞中的表达,该连接酶催化其转录因子Kruppel样因子5的泛素化和随后的降解,通过1-磷酸鞘氨醇(S1P)受体1。相反,S1P水平低于nHDL的dHDL在降低HDACA表达方面的效果要差得多。


9.12-1.png

背景介绍:

冠状动脉疾病(CAD),也称为缺血性心脏病,是世界范围内死亡的主要原因。在过去的二十年里,临床前研究刺激了旨在刺激冠状血管生长作为CAD治疗方法的临床试验。不幸的是,这些试验失败了。因此,目前还没有有效的方法来促进CAD患者的冠状血管生长。失败的原因可能有很多,但一个共识是,导致CAD患者血管疾病和内皮功能障碍的无数风险因素比在没有血管疾病的临床前模型中刺激血管生长的任务复杂得多。一个值得注意且可能被低估的风险经常涉及高密度脂蛋白(HDL)的修饰。正常高密度脂蛋白(nHDL)可诱导健康人血管生成。然而,来自冠状动脉疾病患者的高密度脂蛋白经历了各种修饰,变得功能失调(dHDL),并失去了促进血管生成的能力。


图文解析:


9.12图文解析1.png

图1


要点1:

a-b.Ensembl基因组数据库中选择长度大于200-nt的转录本来获得转录本的初步信息。寻找dHDL中表达水平高于nHDL组的转录本(P值≤0.05,Fold Change≥1.5)。重点研究了dHDL组中相对高丰度的转录本(RPKM≥0.5)鉴定了五个候选转录本。

c-d.使用特定的小干扰RNA(siRNA)和反义寡核苷酸(ASONs)敲除这五个转录本,以评估它们对血管生成的影响。敲低ENST00000562749.1可促进人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的管状形成和增殖,而敲低其他四个候选转录本则没有影响。此外,这五个转录本中的任何一个敲低都不会影响内皮细胞的迁移。因此,选择ENST00000562749.1进行进一步的研究。e.Ensembl基因组浏览器中,ENST00000562749.1由位于X染色体前链的MRFAP1P1基因编码。为了确定ENST00000562749.1的确切序列,进行5′和3′快速扩增互补DNA末端(RACE)检测,发现了一个553-nt的转录本。称之为HDRACA。

f.荧光原位杂交(FISH)分析表明,HDRACA主要定位于HUVECs的细胞质中,核和细胞质分离也证实了这一点。

g.发现nHDL降低了各种类型内皮细胞中HDRACA的表达,而dHDL在下调HDRACA方面不如nHDL有效。这些数据表明,HDRACA是一种主要定位于HUVECs细胞质中的553-nt lncRNA,nHDL可以下调HDRACA在HUVECs中的表达水平,而dHDL的作用不如nHDL,这与lncRNA-seq结果一致。



9.12图文解析2.png

图2


要点2:

a.由于HDL通常通过与细胞受体相互作用来调节内皮细胞的活性,设计了siRNA来敲除内皮细胞上最常见的五种HDL受体。敲低ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)、ATP结合盒转运蛋白G1(ABCG1)、SRB1和S1P受体3(S1P3)不影响nHDL和dHDL对HDRACA的调节作用。然而,当S1P1被敲低时,nHDL和dHDL都不能下调HDRACA的表达。S1P1抑制剂W146阻断了nHDL和dHDL降低HDRACA水平的能力。

b.从血浆中提取HDL来测量其S1P含量时,CAD患者的dHDL所含的S1P含量明显低于健康个体的非HDL。

c.RT-qPCR结果显示,S1P以剂量依赖性方式降低huvec中HDRACA的表达。在高密度脂蛋白中,大多数S1P与ApoM结合,ApoM水平在非高密度脂蛋白和高密度脂蛋白之间没有显著差异。重组人ApoM(r-ApoM)结合S1P(r-ApoM-S1P)对HUVECs中HDRACA的抑制作用强于游离S1P。

d.在高密度脂蛋白中,大多数S1P与ApoM结合,ApoM水平在非高密度脂蛋白和高密度脂蛋白之间没有显著差异。重组人ApoM(r-ApoM)结合S1P(r-ApoM-S1P)对HUVECs中HDRACA的抑制作用强于游离S1P。

e.根据JASPAR(一个转录因子结合谱数据库),与血管生成密切相关的转录因子KLF5被预测以典型结合基序结合到HDRACA的启动子上。染色质免疫沉淀(ChIP)测序数据集(GSE127670)揭示了GM12878细胞中HDRACA启动子处KLF5的峰值。

f-g.此外,多个在线组蛋白ChIP-seq数据集(GSM945181、GSM733673、GSE96250和GSM733691)显示,H3K4me3和H3K27ac在HUVECs中的峰值与GM12878细胞中HDRACA启动子中两个KLF5的峰值位于同一区域。因此,评估了nHDL和dHDL是否通过差异调节KLF5活性来影响HDRACA水平。尽管nHDL和dHDL都不影响HUVECs中KLF5 mRNA的水平,但nHDL有效地下调了KLF5蛋白水平,而dHDL的影响较小。

h.nHDL增加了HUVECs中KLF5的泛素化,而dHDL的作用要小得多,这表明nHDL和dHDL对KLF5的泛素化有差异调节,从而影响其降解。

j.通过ChIP-RT-qPCR证实了KLF5与HDRACA启动子区之间的相互作用。使用BECN1启动子作为阳性对照,该启动子先前已被证明与KLF5结合。

k.此外,KLF5敲低会减弱HDRACA启动子中KLF5的富集。进一步用一系列携带HDRACA 5′-侧翼区域序列缺失的荧光素酶报告基因构建物转染HUVECs。观察到在HDRACA转录起始位点上游从-1115到-65碱基对的序列缺失后,荧光素酶活性增强。

l.此外,转染pGL4.1报告质粒后,KLF5结合位点[+73至+82]的核苷酸突变使荧光素酶活性丧失。



9.12图文解析3.png

图3


要点3:

a-c.在HUVECs中沉默HDRACA后,进行了mRNA测序,并对差异表达基因进行GO和KEGG通路分析。流式细胞术分析显示,沉默HDRACA增加了S/G2/M期HUVECs的比例。相比之下,用编码HDRACA的慢病毒转染HUVECs降低了S/G2/M中HUVECs的比例。

d-e.通过CCK-8试剂盒和5-乙基-2′-脱氧尿苷(EDU)掺入实验来验证HDRACA对内皮细胞增殖的潜在影响。nHDL和r-ApoM-S1P促进HUVECs增殖;然而,dHDL不如nHDL有效。HDRACA的沉默促进了HUVECs的增殖。过表达HDRACA不仅能显著抑制HUVECs的增殖,还能减弱nHDL和r-ApoM-S1P的促进作用。

f-g.nHDL促进HUVEC迁移;与增殖不同,HDRACA的沉默或过表达并不影响HUVEC的迁移。此外,确定HDRACA对nHDL、dHDL和r-ApoM-S1P调控的管形成的影响,这与细胞增殖的研究结果一致。



9.12图文解析4.png

图4


要点4:

a-c.使用生物素化HDRACA进行RNA下拉测定,然后进行质谱分析。在与HDRACA特异性相关的蛋白中,RAIN是富集程度最高的蛋白之一。

b-c.通过RNA下拉和RNA免疫沉淀(RIP)实验证实了RAIN和HDRACA之间的相互作用。

d.此外,HDRACA FISH和RAIN免疫荧光显示HDRACA与RAIN在HUVECs细胞质中共定位。EdU掺入实验结果证实,敲低RAIN抑制了nhdl诱导的HUVECs增殖。

e-g.为了进一步确定HDRACA与RAIN相互作用的片段,根据二级结构构建了一系列的HDRACA,发现HDRACA的核苷酸304-358形成茎环结构,并且是唯一与RAIN结合的基序。删除HDRACA的核苷酸304-358使HDRACA与RAIN之间的相互作用失效,表明该片段参与了与RAIN的结合。

h-i.nHDL增强了RAIN与vigilin的相互作用,dHDL不如nHDL有效。沉默HDRACA促进RAIN与vigilin结合,而过表达HDRACA显著阻碍RAIN与vigilin之间的相互作用,并减弱nHDL增强RAIN与vigilin之间相互作用的能力。



9.12图文解析5.png

图5


要点5:

a.根据KEGG分析,推测HDRACA-RAIN-vigilin相互作用调节了参与细胞周期的基因的表达。为了进一步探讨HDRACA-RAIN-vigilin相互作用对这些基因的影响,

b.进行了一系列RT-qPCR检测。HDRACA敲低可提高细胞周期相关基因CCNA2、CCNB1、CCNB2、CDC6、CDC25A、TFDP1、MYC、YWHAH、MAD2L1、PCNA和PKMYT1的mRNA水平。

c-d.选择HDRACA敲低后表达增加50%以上的基因进行进一步研究。在上调的基因中,RAIN敲低下调了CCNA2、CCNB1、CDC6、TFDP1、YWHAH、PCNA和PKMYT1的mRNA水平而vigilin的敲低上调了CDC6,PCNA,TFDP1,PKMYT1和YWHAH的mRNA水平。

e.迄今为止,报道最多的vigilin的功能机制涉及与mRNA结合并调节mRNA的稳定性和翻译。RIP实验证实,在HUVECs中,vigilin蛋白与PCNA mRNA结合,而不与HDRACA结合。

f-g.nHDL增加了PCNA蛋白的表达,但dHDL的作用不如nHDL。沉默HDRACA可有效增强PCNA蛋白的表达,而过表达HDRACA可下调PCNA蛋白的表达,并减弱nHDL增加PCNA蛋白表达的能力)。

h-i.进一步进行EdU掺入和成管实验,以确定PCNA在nHDL和dhdl调节的内皮细胞增殖和成管中的作用。PCNA敲低抑制HUVEC增殖和成管,减弱nHDL的促进作用。



9.12图文解析6.png

图6


要点6:

a.为HDRACA在物种间的保守性很差。通过BLAST在小鼠基因组中没有找到明确的同源对偶。因此,在小鼠股动脉内皮细胞(mFAECs)中异位表达人HDRACA,以验证其对血管生成的调节作用。利用过表达HDRACA的慢病毒成功地在mFAECs中表达了人HDRACA。

b-c.HDRACA过表达抑制mFAECs增殖和小管形成。由于RAIN的蛋白序列在人和小鼠之间高度保守且相同,检测了人HDRACA是否可以与mFAEC中的RAIN结合。

d-e.RNA pull-down和RIP实验证实,在mFAECs中,人HDRACA也能与小鼠RAIN结合。这些结果表明,HDRACA抑制人和小鼠内皮血管生成。



9.12图文解析7.png


图7


要点7:

a-b.通为了验证HDRACA在体内的调节作用,通过手术减少了C57BL/6小鼠左后肢的血流量,并在这些缺血后肢中异位表达了人HDRACA。C57BL/6小鼠的后肢成功表达了人HDRACA。

c.激光多普勒灌注成像显示,与对照载体(AdV-Ctrl)或生理盐水(NS)组相比,携带HDRACA的腺病毒载体(AdV-HDRACA)转导小鼠的血流恢复受到抑制。

d.微计算机断层扫描(micro-CT)分析显示,HDRACA的异位表达显著降低了缺血后肢侧支血管密度。

e.CD31免疫荧光染色显示,HDRACA的异位表达降低了毛细血管密度。

f.异位表达HDRACA可下调缺血后肢内皮细胞中的PCNA水平,但不影响RAIN和vigilin水平。



9.12图文解析8.png

图8


要点8:

a-b.为了评估HDRACA在人体组织中的潜在翻译相关性,使用CD31免疫荧光法标记下肢动脉内皮细胞,然后与KLF5、HDRACA或PCNA共染色。ASO患者下肢动脉内皮细胞中KLF5、HDRACA表达上调,PCNA表达下调。

c-d.此外,HDL中S1P含量与下肢动脉内皮细胞中HDRACA水平呈负相关。这一发现初步证实了ASO中S1P-KLF5-HDRACA-PCNA信号的改变。


本文小结:

综上所述,本研究为nHDL增加KLF5的泛素化从而下调其蛋白水平,从而通过S1P1抑制HDRACA的表达提供了直接证据。结果,RAIN与vigilin的相互作用增强,vigilin与PCNA mRNA的结合减弱,从而增加PCNA的表达,刺激血管生成。相比之下,dHDL在刺激血管生成方面的效果要差得多。发现揭示了nHDL诱导血管生成的新机制,并解释了为什么dHDL不诱导血管生成。


参考文献:

Mo, ZW., Peng, YM., Zhang, YX. et al. High-density lipoprotein regulates angiogenesis by long non-coding RNA HDRACA. Sig Transduct Target Ther 8, 299 (2023).

https://doi.org/10.1038/s41392-023-01558-6



初源云医疗
初源云医疗专注于医学科研版块,业务涵盖细胞基因修饰、病毒包装、合成生物学、单细胞测序、蛋白质组学、基因编辑动物、药品上市后药效研究等科研技术服务和成果转化。 基石启航医疗与香港基石生物、探罕科学研究有限公司、松诺生物及香港科技大学、沈阳医学院等国内外知名机构有着深度合作关系,旨在促进资源共享和技术交流,加速研究成果的转化和应用
资讯与资源
新媒体矩阵
合作伙伴