IF25 Gut|跨膜蛋白MS4A4A在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中选择性高表达前言： 2023年7月28日，南方医科大学邓海军、方媛及李国新等研究人员在《Gut》杂志上在线发表题为“Targeting MS4A4A on tumour-associated macrophages restores CD8+T-cell-mediated antitumourimmunity”的研究论文，该研究揭示MS4A4A+ TAMs在调节肿瘤细胞免疫逃逸中的作用，并开发了针对TAMs的新治疗策略，以提高免疫检查点抑制剂(ICI)在结直肠癌中的疗效。MS4A4A在不同类型的肿瘤中由TAMs选择性表达，并与癌症患者的不良临床结果相关。体内抑制MS4A4A和抗MS4A4A单克隆抗体治疗均可抑制肿瘤生长，提高ICI治疗效果。
背景介绍： 免疫疗法的出现开创了癌症治疗的新时代，尽管如此，在结直肠癌(CRC)患者中获得免疫治疗益处的临床需求尚未得到满足。目前，只有MSI-H不稳定性肿瘤CRC亚群可以从免疫检查点抑制剂(ICIs)中获益。然而，MSI-H型CRC仅占所有CRC病例的15%。在晚期结直肠癌中，这一比例更低，仅占4-5%。因此，仍然迫切需要进一步扩展CRC免疫治疗以使更广泛的患者群体受益。 图文解析：
图1 要点1： A-B.MS4A4A在TAM中选择性上调，并与癌症患者预后不良相关。巨噬细胞是浸润CRC的最丰富的免疫细胞类型之一。结直肠癌中累积的TAM与肿瘤进展和治疗效果有关。许多研究表明，TAM经常受到肿瘤细胞适应和向M2表型极化的影响，进而诱导T细胞衰竭，介导对ICI治疗的抗性。为了寻找与M2型极化和T细胞耗竭相关的关键调控分子，首先使用巨噬细胞基因表达Omnibus微阵列数据筛选M2巨噬细胞中的差异表达基因(DEGs)。随后，综合分析了IRs在The Cancer Genome Atlas (TCGA)和GSE17538 CRC数据集中的表达特征，包括PDCD1、TIGIT、CTLA4、LAG3、HAVCR2和CD160，并鉴定出一系列与IRs高度相关的基因。最后，对上述基因进行交叉分析，鉴定出一个基因:MS4A4A。在GSE39582 CRC数据集中，进一步验证了MS4A4A与各种M2标记物和T细胞衰竭标记物的表达呈显著正相关。为了确认MS4A4A与T细胞衰竭的关联是否普遍存在，分析了多种肿瘤中MS4A4A表达与T细胞衰竭特征的关联。引人注目的是，MS4A4A的表达与T细胞耗竭特征高度相关，这表明MS4A4A+ TAM的存在表明免疫抑制和耗竭的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞。利用肿瘤免疫单细胞中心(Tumor Immune Single-cell Hub,TISCH)数据库和免疫荧光分析，发现MS4A4A基因在包括CRC在内的多种肿瘤的TAM中特异性表达，并且MS4A4A蛋白在CRC组织中与TAM共定位。 C-D.最近的一项研究表明，TAM可分为两个细胞亚群，C1QC+ TAM和SPP1+ TAM在这里，MS4A4A主要在C1QC+ TAM中表达，这是一个与T细胞衰竭相关的亚组，并且它们的M2标记物表达高于SPP1+ TAM。此外，使用GEPIA2021在线工具，发现各种肿瘤的M2巨噬细胞中MS4A4A基因表达显著上调。随后，用不同的细胞因子刺激人外周血单核细胞、人THP-1单核细胞和小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDM)，诱导M1或M2极化。研究结果显示，M2巨噬细胞中MS4A4A的信使RNA(mRNA)和蛋白水平显著上调。然后用结直肠癌细胞系培养上清液刺激上述巨噬细胞分化为TAM。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测显示，与对照组相比，TAM中MS4A4A mRNA水平显著上调。通过免疫组织化学(IHC)染色评估了人结直肠癌组织芯片中MS4A4A+细胞的浸润水平，然后根据整个队列中MS4A4A+细胞的平均密度将结直肠癌患者分为MS4A4A+细胞高密度组和低密度组。Kaplan-Meier分析显示，高MS4A4A+细胞密度与较差的总生存期(OS)相关。 E.外部数据集也证实，高MS4A4A mRNA水平可以预测各种肿瘤的OS明显较差。因此，这些数据表明TAM中MS4A4A的上调与肿瘤发展相关。
图2 要点2： A.为了研究MS4A4A是否调节M2极化，使用MS4A4A特异性小干扰RNA(siRNA)(siMS4A4A)干扰BMDM中MS4A4A的表达，并通过添加白细胞介素(IL)-4/IL-13将其极化为M2表型。观察到，与对照组(对照siRNA(siNC))相比，siMS4A4A组M2标记物(即Fizz1,Mgl2,Arg1 and Tgfb1)的表达显著降低。 B.利用慢病毒构建稳定过表达MS4A4A的THP-1细胞系，用PMA诱导THP-1细胞分化为M0巨噬细胞，再用IL-4诱导M2极化。结果显示，与对照组相比，MS4A4A过表达组大部分M2标记上调。 C.为了更好地模拟肿瘤细胞对巨噬细胞在TME中的作用，制备了小鼠CRC细胞衍生条件培养基(CM)，然后用CM培养不同水平表达MS4A4A的bmdm，诱导其成为TAM。 D-E.结果显示，与空白对照相比，单独添加CM可显著上调巨噬细胞中MS4A4A和ARG1 mRNA的表达。然而，当MS4A4A的表达受到干扰时，CM对巨噬细胞ARG1 mRNA表达的调控被显著恢复。 F.此外，流式细胞术(FACS)分析显示，干扰MS4A4A表达降低了tam中CD206蛋白的表达，表明MS4A4A缺乏降低了TAM中M2样巨噬细胞的比例。 G.此外，构建了过表达MS4A4A的巨噬细胞细胞系进行同样的实验，得到了一致的结果。接下来，用CM刺激不同MS4A4A表达水平的BMDMs转化为TAM，并收集TAM培养上清。结果显示，与对照组相比，MS4A4A表达干扰组TAM培养上清中抗炎细胞因子IL-10、TGF-β1的表达明显下调。而过表达MS4A4A可显著上调TAM培养上清中这两种细胞因子的水平，说明MS4A4A+巨噬细胞具有更强的免疫抑制能力。为了进一步证实MS4A4A对TAM功能转化的影响， H-I.用羧基荧光素琥珀酰氨基酯(CFSE)标记MS4A4A差异表达的BMDMs(siNCCD45.2和siMS4A4A-CD45.1)，然后将两种细胞类型的混合物转移到MC38荷瘤小鼠体内。FACS分析显示，与MC38肿瘤中siMs4a4a-CD45.1-TAMs相比，siNC-CD45.2-TAMs中M2标记物的表达显著下调。由于TAMs的主要致病活性是抑制抗肿瘤免疫反应，随后测试了TAM的MS4A4A表达对T细胞增殖能力的抑制作用。 J-K.与对照处理相比，抑制MS4A4A表达可显著增强共培养CD8+T细胞的增殖能力，说明TAM对T细胞的抑制作用减轻。综上所述，这些结果表明MS4A4A显著促进M2-TAM极化，导致更具免疫抑制性的TME。
图3 要点3： A.为了探索MS4A4A是否调节巨噬细胞极化从而影响体内肿瘤生长，使用体内优化的靶向MS4A4A基因的siRNA(siMs4a4a)或对照siRNA(siNC)来治疗接种MC38或CT26细胞的免疫能力小鼠。 B-D.结果显示，通过体内优化的RNA干扰(RNAi)抑制MS4A4A可显著延缓肿瘤生长。通过分析肿瘤、外周血和脾脏中的免疫细胞组成，观察到siMS4A4A治疗小鼠的抗肿瘤免疫增强，巨噬细胞显著减少，CD8+T细胞增加。 E-F.此外，发现siMS4A4A组肿瘤浸润性CD8+T细胞(IFN-γ和Ki67)的活性显著增加， G-J.而T细胞衰竭标志物(PD-1和TIM3)的表达水平和M2-TAM浸润水平显著降低。 K-N.接下来，为了验证MS4A4A抑制剂对结直肠癌生长的抑制作用是否依赖于巨噬细胞，使用氯膦酸脂质体去噬小鼠巨噬细胞。结果显示，巨噬细胞耗尽后，抑制MS4A4A对CRC生长的影响明显恢复。为了进一步证实MS4A4A在TAM中的促瘤作用，采用GFP标记过表达MS4A4A的BMDMs(OE-MS4A4A-GFP)和对照BMDMs(OE-NC-GFP)转染MC38细胞预激小鼠。研究结果表明，与对照组相比，OE-MS4A4A-GFP BMDM显著促进了宿主小鼠MC38肿瘤的生长。然而，巨噬细胞耗损明显消除了MS4A4A的促瘤作用。 O-T.此外，为了探究MS4A4A抑制CRC生长的抑制作用是否由CD8+T细胞介导，给小鼠模型注射了抗CD8抗体。发现，用抗CD8抗体消耗CD8+T细胞可以阻断siMS4A4A处理小鼠对肿瘤生长的抑制。为了评估体内注射siRNA是否能直接抑制肿瘤细胞增殖，在体外用MS4A4A特异性siRNA处理肿瘤细胞，发现siRNA处理不影响肿瘤细胞增殖。上述实验证实，体内抑制巨噬细胞MS4A4A可延缓结直肠癌的进展，这种肿瘤抑制作用依赖于巨噬细胞和CD8+T细胞的存在。
图4 要点4： A.接下来，为了研究MS4A4A促进M2极化的分子机制，将MS4A4A过表达质粒或对照质粒转染到BMDMs中，并用MC38条件培养基(MC38-CM刺激它们。 B-D.通过对这些TAM进行RNA测序(RNA-seq)分析，发现在MS4A4A过表达组中，几乎所有M2巨噬细胞相关基因都上调，而大多数M1巨噬细胞相关基因下调。此外，使用上述RNA-seq数据和TCGA CRC数据集进行基因富集分析。 E-F.发现JAK/STAT和PI3K/AKT/mTOR通路在过表达MS4A4A的巨噬细胞(OE-MS4A4A)和MS4A4A高表达的结直肠癌患者中显著富集。 G-I.既往研究表明，PI3K/Akt/mTOR、JAK/STAT6和JAK/STAT3通路在调控巨噬细胞M2极化中发挥重要作用。为了研究这些通路是否介导MS4A4A对M2极化的调节，用MC38-CM刺激差异表达MS4A4A的巨噬细胞，模拟肿瘤细胞对巨噬细胞的极化作用。结果显示，MS4A4A促进巨噬细胞中AKT和STAT6的磷酸化，但不影响STAT3的磷酸化。 J-K.此外，使用PI3K抑制剂(BEZ235)或STAT6抑制剂(AS1517499)治疗过表达MS4A4A的巨噬细胞，发现这两种抑制剂都能显著抑制MS4A4A上调巨噬细胞中M2型标记物表达的作用。为了研究哪些PI3K亚型介导了MS4A4A对TAM M2极化的影响，用不同PI3K亚型的抑制剂治疗巨噬细胞。结果表明，PI3Kγ亚型抑制剂可以显著恢复MS4A4A介导的M2极化促进。
图5 要点5： 为了评估MS4A4A+巨噬细胞靶向策略增强抗肿瘤反应的潜力，用了最近开发的MS4A4A单抗，该单抗能够识别人MS4A4A和小鼠MS4A4A。 A-B.首先，为了验证抗MS4A4A单抗在体外对TAM极化的影响，用MC38-CM和抗MS4A4A单抗处理BMDM。qRTPCR和FACS分析显示，抗MS4A4A显著逆转MC38-CM诱导的M2极化，促进M1极化，表明抗MS4A4A处理阻断了TAM的M2极化。此外，体外共培养实验表明，与肿瘤细胞和巨噬细胞共培养可显著抑制CD8+T细胞功能。然而，添加anti-MS4A4A mAb可以显著恢复CD8+T细胞的功能。 E-G.为了验证抗MS4A4A单抗对CRC体内生长的影响，使用抗MS4A4A单抗治疗荷瘤小鼠。结果显示，抗MS4A4A显著抑制小鼠CRC。 H-K.FACS分析显示，抗MS4A4A组细胞浸润M2-TAM(F4/80+CD206+)水平和CD8+T细胞衰竭标志物(PD-1和TIM3)表达显著降低，而CD8+T细胞增殖(Ki67)和效应功能(IFN-γ)显著增强。 L-O.同样，免疫组化染色和qRT-PCR数据也显示抗MS4A4A组M2-TAM和耗竭T细胞减少。随后，建立AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型进行进一步验证，也得到了一致的结果。利用cytometry by time of fligh(CyTOF)技术，分析了IgG或抗MS4A4A单抗处理的CT26模型的肿瘤浸润免疫细胞。 P-R.将总细胞群分为11个亚簇，抗MS4A4A组巨噬细胞群明显减少，而CD8+T细胞群增加。进一步分析表明，增加的巨噬细胞主要呈现M2表型。 S-T.与之前的结果一致，CyTOF结果显示，anti-MS4A4A组的TAMs的M1标记物(iNOS和MHCII)、增殖标记物(Ki67)和CD8+T细胞的活化标记物(Tbet、CD27、ICOS和CD69)上调。相反，M2标记物(CD206)和免疫抑制分子(CD39、SIRPa)的表达在TAM中下调。为了研究MS4A4A mAb组的肿瘤抑制作用是否与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用有关，给小鼠模型注射了ADCC阻断抗体(CD16/CD32mAb)。研究结果显示，添加CD16/CD32mAb部分减弱了MS4A4A mAb诱导的TAM浸润减少，但不影响MS4A4A mAb介导的肿瘤抑制。这些结果表明，体内阻断MS4A4A可延缓肿瘤进展并重塑免疫抑制时间。
图6 要点6： A-E.基于PD-1/程序性死亡配体1(PD-L1)的治疗靶向CD8+ T细胞，但这些细胞实际上受到TME中的TAM的密切调节，这使得靶向TAM成为另一种潜在的免疫治疗方法在这项研究中，证明了MS4A4A阻断治疗延迟肿瘤生长和重塑时间。此外，CyTOF分析显示，抗MS4A4A治疗后，肿瘤中PD-1+CD8+ T细胞和PD-L1+巨噬细胞数量显著增加。研究表明，肿瘤浸润性CD8+ T细胞水平和TME中PD-L1的表达是抗PD-1/PD-L1治疗的生物标志物。因此，推测MS4A4A阻断可能与抗PD-1治疗具有协同作用。在这里，构建了三种不同的肿瘤模型，它们具有一系列的免疫原性和对抗PD-1/PD-L1治疗的敏感性。CT26和MC38模型是免疫原性结肠癌模型，分别对抗PD-1/PD-L1部分治疗反应较差。B16F10黑色素瘤是一种免疫原性差的肿瘤模型，对抗PD-1/PD-L1治疗反应较差首先，使用MS4A4特异性siRNA联合抗PD-1单抗治疗MC38荷瘤小鼠，发现抗PD-1或单独使用siMS4A4A治疗可抑制肿瘤生长。然而，两者联合治疗可进一步抑制肿瘤生长并提高小鼠的存活率。在CT26模型中也得到了类似的结果。FACS分析显示，联合治疗可显著降低肿瘤中T细胞衰竭标志物的共表达，增强CD8+ T细胞效应功能和增殖。同样，使用抗MS4A4A单抗联合抗PD-1单抗治疗CT26荷瘤小鼠。与siMS4A4A的作用一致，观察到联合治疗组CT26肿瘤的生长速度比单药治疗组慢，并且该组的OS明显延长。 F.进一步检查显示各组间体重无差异，提示抗MS4A4A单抗在小鼠模型中可能具有有限的一般毒性。 G-O.在B16F10模型和CT26原位种植体模型中也观察到类似的结果。 P-Q.为了测试联合治疗是否能引发长期记忆T细胞反应，保护小鼠免于肿瘤复发，使用CT26细胞重新刺激存活小鼠，观察到重新刺激的存活小鼠肿瘤完全消退。总的来说，这些体内动物实验结果表明，MS4A4A阻断治疗可产生有效的T细胞介导的抗肿瘤作用，并通过记忆T细胞反应防止肿瘤复发。进一步，研究了MS4A4A蛋白水平与CRC患者免疫治疗反应的临床相关性。在免疫治疗前获得了12份结直肠癌样本进行免疫组化分析。 R.结果显示，高MS4A4A表达与免疫治疗无应答密切相关，而应答者往往具有显著低MS4A4A蛋白表达。 S-T.利用公共数据库，发现在几种癌症类型中，MS4A4A高表达的患者在免疫治疗后的总生存率和无进展生存率往往较低。总之，这些数据提示MS4A4A的高表达可能是癌症患者对免疫治疗无反应的标志。
图7 要点7： A.抗PD-1治疗的效果与预处理肿瘤大小有关，此外，已建立的肿瘤倾向于发展复杂的免疫抑制网络，对免疫治疗有耐药性本研究通过流式细胞术对不同大小肿瘤中的TAM进行了分类，qRT-PCR数据显示，较高的Ms4a4a mRNA表达水平与肿瘤大小显著相关。 B.因此，推测抗MS4A4A/PD-1治疗可能对更晚期、更大的CRC肿瘤产生协同作用。为了验证这一假设，构建了一个大的CT26肿瘤模型(体积>300mm3)。 C-F.结果显示，单独抗PD-1治疗对CT26肿瘤的生长无显著影响，而联合MS4A4A mAb可显著抑制肿瘤生长。这些数据表明，抗MS4A4A治疗重新建立了大型CRC肿瘤对抗PD-1治疗的敏感性。研究表明，包括CD8+ T细胞在内的多种浸润性免疫细胞群在大肿瘤中比在小肿瘤中更少发现。在这项研究中，anti-MS4A4A/PD-1治疗在一定程度上减缓了大肿瘤的生长，但没有诱导肿瘤消退。推测这可能与肿瘤内T细胞浸润减少有关。 G.许多研究证实放射治疗(RT)可以增加T细胞对肿瘤的浸润。因此，推测RT联合抗MS4A4A/PD-1治疗可以进一步抑制CRC肿瘤的生长。随后，使用抗MS4A4A/PD-1单克隆抗体联合RT治疗肿瘤。 H-J.结果显示，三种治疗方法联合使用可促进大肿瘤明显消退，显著提高小鼠存活率。 K.此外，免疫组化实验显示，抗MS4A4A/PD-1联合RT显著增加了肿瘤内CD3+ T细胞和CD8+ T细胞的浸润。总的来说，这些结果表明，anti-MS4A4A/PD-1治疗与RT联合更有效，并且具有转化为临床的潜力。 本文小结： 综上所述，抗MS4A4A治疗不仅可以延缓肿瘤进展，重塑肿瘤免疫微环境(TIME)，还可以增强抗程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)治疗的疗效。 参考文献： Li Y, Shen Z, Chai Z, et al. Targeting MS4A4A on tumour-associated macrophages restores CD8+ T-cell-mediated antitumour immunity. Gut.2023 Jul 28;gutjnl-2022-329147. https://gut.bmj.com/content/early/2023/07/28/gutjnl-2022-329147 |
