IF 16.6 Nature Communications│当溶酶体功能受损时，线粒体被分泌到细胞外囊泡中

前言：

2023年8月18日，美国加利福尼亚州拉霍亚加州大学圣地亚哥分校的Åsa B. Gustafsson教授团队在Nature Communications上发表了题为“Mitochondria are secreted in extracellular vesicles when lysosomal function is impaired”的研究论文，这些发现证实了在溶酶体降解被抑制的情况下，大的细胞外囊泡（EV）中的线粒体通过内体途径被清除。

背景介绍：

线粒体质量控制对于心脏稳态至关重要，因为这些细胞器负责产生维持收缩所需的大部分能量。功能失调的线粒体通常通过聚集在溶酶体上的细胞内降解途径进行降解。心肌细胞的收缩需要高水平的ATP，而ATP是由线粒体氧化磷酸化提供的。然而，功能失调的线粒体产生过量的活性氧(ROS)会对细胞成分造成损伤，这些细胞器也可以直接激活细胞死亡途径。因此，有效清除异常线粒体对维持细胞稳态和心脏功能至关重要。一个不同的线粒体清除机制,涉及到当RAV7被删除或溶酶体功能受损时,细胞中线粒体的分泌。当溶酶体功能受到损害时,这种机制可以作为一种替代性的细胞质量控制途径来发挥作用,以保护细胞免受将会退化的有害物质的积累。

图文解析：

图1

要点1：

a-b.对从条件培养基中分离的EV组分进行Western blotting检测，发现大、小EV组分均为Alix、Tsg101和CD81阳性，这些都是MVBs10来源的EVs的既定标志物。这些EV标志物在Baf A1处理后显著增加，表明在抑制溶酶体酸化过程中EVs的分泌增加。

c.接下来，研究人员对基线条件下MEFs分泌的大、小EVs进行蛋白质组学分析，比较其组成和含量。在小型肠道病毒中鉴定到的蛋白中，80%的蛋白也存在于大型肠道病毒中。

d.此外，对仅存在于大EVs中的519个蛋白进行GO富集分析显示，包括线粒体在内的膜结合细胞器富集。相反，小的EVs富集在含蛋白质复合物、细胞质和细胞质中。总的来说，这些发现表明破坏溶酶体酸化会导致细胞中大、小EVs的分泌增加，并且大EVs可能含有完整的线粒体。

e-f.为了研究破坏溶酶体功能是否会增强体内EVs的释放，研究人员给小鼠注射了氯喹(CQ)，一种可以增加溶酶体pH的趋溶酶体药，并研究了给药后24 h心脏组织细胞外间隙和血浆中EV含量的变化。虽然研究人员观察到CQ给药后血浆中循环EVs没有增加，但研究人员发现CQ处理导致心脏组织中大EVs水平增加。

g.为了研究大型EVs中的线粒体是否来源于心肌细胞，研究人员通过培育光激活线粒体(PhAM^f/f)和Myh6-Cre小鼠，获得了心肌特异性表达线粒体Dendra2荧光蛋白的小鼠(mito-Dendra2)。

h-i.使用差速离心法从mito-Dendra2小鼠心脏中分离出的大EV组部分Tim23和mito-Dendra2均呈阳性，表明心肌细胞是含有EVs释放到细胞外空间的线粒体的主要来源。

图2

要点2：

a-b.由于小GTP酶Rab7有利于MVB与溶酶体融合，因此研究人员研究了Rab7缺失对大、小EVs释放到条件培养基中的影响。EV组分的Western blot分析显示，与WT MEFs相比，Rab7^-/-MEFs在基础状态下向条件培养基中释放的大和小EVs增加。大胞外囊泡还表达线粒体蛋白Tim23和MnSOD，以及内质网蛋白内质网钙结合蛋白，仅在Rab7^-/-MEFs来源的大胞外囊泡组分中表达增加。

c.研究人员通过定量囊泡内的线粒体DNA(mtDNA)，进一步验证了在大EV组分中整个线粒体水平的增加。

d.此外，负染色电子显微镜(EM)分析证实了分离的小型和大型EVs的大小和球形形态。

e.此外，透射电子显微镜(TEM)显示，从Rab7^-/-MEFs的条件培养基中分离出的大型EVs中存在线粒体。

f.用蛋白酶K处理由Rab7-/-MEFs分泌的大型EVs，验证了Tsg101和Tom20在暴露的CD81被消化的同时被膜保护。

g.纳米颗粒跟踪分析(NTA)显示WT和Rab7^-/-MEFs释放的大和小EVs的尺寸分布。

h.研究人员从Rab7^-/-MEFs中鉴定到103个显著富集于EV大组分的蛋白，包括多种线粒体和内质网蛋白。

i.GO分析也证实，从Rab7-/-细胞中分离的大型EV中，与细胞器和各种代谢过程相关的蛋白质分别在细胞组分和生物过程类别中富集。综上所述，这些结果表明Rab7缺失导致细胞释放大、小EVs增加。

图3

要点3：

a.此外，对WT和Rab7^-/-MEFs中CD81阳性囊泡的免疫荧光分析证实，在基线和Baf A1处理后的WT细胞中，Rab7^-/-MEFs中CD81阳性囊泡与线粒体细胞色素c之间的共定位增加。

b.相关的光学和电子显微镜也证实了Rab7^-/-MEFs中CD81阳性囊泡中线粒体的存在。

c.活细胞成像显示GFP-CD81阳性囊泡向线粒体募集。总的来说，这些发现表明在Rab7缺失的细胞中内体活性增强，并且Rab7缺失导致线粒体被隔离到CD81阳性的囊泡中进行分泌。

图4

要点4：

a-b.有研究报道，细胞分泌某些囊泡依赖于自噬体的形成。因此，研究人员通过评估WT和自噬缺陷的Atg5^-/-MEFs中的EV释放来检查大型EV中线粒体的分泌是否需要功能性自噬。尽管自噬体形成受损，Baf A1的存在导致Atg5^-/-MEFs中含有线粒体的大EVs的释放显著增加。

c-d.有趣的是，来自WT细胞的大EV组分也呈LC3II阳性，LC3II是存在于自噬体膜上的蛋白，自噬接头蛋白p62/SQSTM1也呈阳性。与Atg5缺失细胞类似，敲低MEFs中的Atg7对BafA1处理诱导的MEFs中EV的分泌没有影响。

e.尽管有自噬体的积累，但p62/SQSTM1的水平在Rab7^-/-MEFs中没有变化。

f.因此，研究人员研究了破坏溶酶体酸化或Rab7缺失是否诱导自噬体和MVB之间的融合。免疫荧光分析显示，在基础状态下，Rab7^-/-细胞中GFP-LC3与CD81的共定位增加，提示双极体形成。

图5

要点5：

a.尽管自噬受损，研究人员在Rab7^-/-MEFs中观察到泛素化蛋白的少量减少。

b.目前尚不清楚为什么内部降解的破坏会导致总泛素化水平的下降，而内部降解的破坏会导致总泛素化水平的增加。然而，研究人员在Rab7^-/-MEFs分泌的大和小EVs中检测到泛素化蛋白水平的增加，这表明替代囊泡途径可以处理细胞内本来会被降解的泛素化产物。

c-d.值得注意的是，研究人员发现与WT细胞相比，Rab7^-/-MEFs中Rab27a的蛋白和mRNA水平显著增加45倍。

e-g.在Rab7^-/-MEFs中敲低Rab27a后，大、小EVs的释放均被抑制，泛素化蛋白水平也有少量但显著的增加。

h.最后，为了检测抑制Rab7^-/-MEFs中EV的释放是否改变了细胞对应激的敏感性，研究人员用Baf A1处理细胞以破坏溶酶体酸化或用寡霉素+抗霉素A(O + AA)处理细胞以抑制线粒体呼吸。在Rab7^-/-MEFs中，Rab27a介导的EV释放的缺失加剧了两种处理后的细胞死亡，这表明这是限制细胞内细胞毒性物质积累的重要机制。

图6

要点6：

a.超声心动图评估显示左心室收缩功能或结构无明显变化。

b.心脏大体检查发现，与MCM和Rab7^f/f小鼠相比，Rab7^f/fMCM小鼠的心脏重量/体重的比值略有增加，但差异显著，提示发生了轻微的心肌肥大。c.然而，心脏组织学分析显示，Rab7^f/fMCM小鼠心脏结构正常，无纤维化。

d.通过TEM在超微结构水平评估变化，证实了正常的肌原纤维结构和线粒体，但发现在Rab7缺失的肌细胞中存在许多小液泡。

e.接下来，研究人员检测了心脏中Rab7的缺失是否与调节内体运输和EV分泌的相关蛋白的变化有关。研究人员发现，在Rab7缺失的心脏中，Rab27、CD81、Tsg101和Arl8b显著增加。

f.与研究人员的体外研究结果一致，在Rab7缺失的心脏中自噬流受损，表现为LC3II和自噬接头蛋白p62的显著积累。

图7

要点7：

a-b.Rab7缺失的心脏在心脏组织中具有增加的大型EVs水平，而MCM小鼠具有与WT相似的EV释放。

c.负染EM证实了从Rab7^f/f和Rab7^f/fMCM心脏组织中分离出的大EVs的大小和球形形态，而NTA显示囊泡大小在~60 nm至~530 nm之间。

d-e.为了进一步证实在EVs中检测到的线粒体来源于心肌细胞，研究人员从Rab7^f/f的心脏组织中分离出总的EVs(大和小)；Mito-Dendra2和Rab7^F/FMCM；Mito-Dendra2小鼠采用免疫亲和纯化。Rab7^f/fMCM小鼠心脏EVs的Western blot分析；Mito-Dendra2小鼠显示Tim23和Mito-Dendra2均为阳性，证实线粒体来源于心肌细胞。总之，这些结果表明心脏特异性Rab7缺失导致自噬降解受损，同时伴随着心脏中含有线粒体的大EVs释放增加。

f-g.心脏切片的免疫荧光染色和流式细胞术显示，Rab7缺失的心脏中心脏巨噬细胞显著增加，但未观察到炎症标志物的转录变化。

h-i.为了评估巨噬细胞是否摄取大的EVs，将羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的WT或Rab7^-/-MEFs条件培养基中分离的EVs加入培养的RAW264.7巨噬细胞中。孵育24 h后，大部分细胞CFSE呈阳性，CFSE荧光团与Lyso Tracker Red共定位，表明EVs被摄取后被递送至溶酶体。

j.最后，对Rab7^f/fMCM制备的心脏切片进行3D成像分析；Mito-Dendra2小鼠证实在CD68阳性的巨噬细胞(红色)内存在Mito-Dendra2(绿色)阳性的线粒体。

图8

要点8：

a-c.研究衰老是否影响体内EVs的释放，研究人员评估了年轻(4月龄)和老年(24月龄)WT小鼠心脏中EVs的分泌水平。研究人员使用差速离心法或免疫亲和纯化法观察到老年小鼠心脏组织中含有线粒体的大EVs水平显著增加。

d-e.Western blot分析显示Lamp2^-/-心脏中含有线粒体的大EVs水平增加。

f.使用针对EV细胞表面标志物的磁珠偶联抗体对EVs(大和小)进行免疫亲和捕获，结果显示，与正常对照心脏相比，Danon病患者心脏组织中线粒体阳性的EVs水平更高。

g.在本研究中，研究人员发现了一种在溶酶体功能受损时从细胞中清除线粒体和泛素化蛋白的替代途径，这涉及到它们在大型EV中的分泌。总的来说，这些发现表明，当内部降解途径受到破坏时，EVs中线粒体的分泌可以作为一种替代的消除途径。

本文小结：

综上所述，研究表明，当溶酶体介导的降解受损时，细胞和心脏中线粒体质量控制的独特过程。由于线粒体是细菌来源的，囊状线粒体的分泌避免了潜在有害的炎症反应的激活。目前，研究者对开发激活心脏自噬功能的疗法产生了浓厚的兴趣。然而，增加自噬体的形成，使其超过溶酶体降解的能力，会导致细胞分泌更多的产物。虽然EV分泌对周围细胞的影响似乎微乎其微，但未来的研究需要阐明过度分泌是否影响心脏中其他细胞类型的功能。

参考文献：

Liang, W., Sagar, S., Ravindran, R. et al. Mitochondria are secreted in extracellular vesicles when lysosomal function is impaired. Nat Commun 14, 5031 (2023).

https://doi.org/10.1038/s41467-023-40680-5