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IF64.8 Nature│UFBP1的泛素化修饰通过调节肝脏内质网应激缓解非酒精性脂肪性肝病

前言:


202392日,上海交通大学医学院附属第九人民医院内分泌代谢科,蚌埠医学院等多个实验室联合在Nature发表题为Ufmylation on UFBP1 alleviates non-alcoholic fatty liver disease by modulating hepatic endoplasmic reticulum stress”的研究论文。研究发现,UFBP1的泛素化对非酒精性脂肪肝的保护作用,并为非酒精性脂肪肝的治疗提供了一个特定的靶点。


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背景介绍:

非酒精性脂肪性肝病( nonalcoholic fatty liver diseaseNAFLD)是最常见的慢性肝脏疾病,包括一系列非酒精性因素引起的肝脏疾病,包括非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitisNASH)、纤维化和肝硬化。NAFLD的全球患病率超过25%,且无法控制NAFLD可进展为致命性肝硬化和肝细胞癌等严重的病理病变。然而,由于NAFLD的复杂性,针对NAFLD特征的治疗策略有限。多种因素决定了NAFLD的进展。脂质代谢异常是NAFLD的一个重要表型。甘油三酯(TriglycerideTG)是肝脏脂质积累的主要形式,胆固醇在NASH的发生发展中起重要作用。同时,血清TG和胆固醇水平升高被公认为NAFLD的预测因子和促发因素。胰岛素抵抗(insulin resistanceIR)NAFLD的另一重要表型。在NAFLD中,IR促进肝脏脂肪生成和脂质沉积。反过来,过多的脂质积累又会加剧IR。此外,血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)可作为NAFLD肝细胞损伤的指标。ER应激是NAFLD的突出特征,促进脂肪生成、IR和肝细胞损伤。在NAFLD中,肝脏内质网应激由脂质积累触发,并激活未折叠蛋白反应(UPR)UPR由三条途径组成:肌醇需求酶1Α(Ire1Α)通路,即Prkr-like内质网激酶(Endoplasmic Reticulum KinasePERK)通路及其激活转录因子6(ATF6)通路。磷酸化的IRE1 α诱导X盒结合蛋白1剪接体(X-boxbinding protein 1 splicedXBP1s)Caspase2的表达,从而诱导肝脏脂肪生成、IR和肝细胞损伤。同样,磷酸化的PERK诱导真核翻译起始因子2亚基的磷酸化Alpha(eIF2α)和激活转录因子4(Activating Transcription Factor 4ATF4)的表达,促进肝脏脂肪变性、IR和肝细胞损伤。研究结果表明针对UFBp1UFmyl治疗是一种潜在的治疗。


图文解析:


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图1


要点1:

A.UFM1和与无脂肪变性的样本相比,UFBP1在脂肪变性的肝脏中表现出更高的表达。

B.同样,IHC分析显示,与正常饮食(normal chow diet,ND)小鼠相比,高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导的NAFLD小鼠肝脏中UFM1和UFBP1的水平升高。

C-D.ND小鼠相比,HFD促进了UFM1和UFBP1的转录(图1C)和UFM1结合蛋白的表达。

E.肝脏蛋白质泛素化修饰的增强可归因于NAFLD中泛素化修饰系统组分(UFM1、UBA5、UFC1、UFL1和UFBP1)的表达增加。

F-I.在游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)(油酸/棕榈酸,2:1比例)诱导的永生化人肝细胞系L02来源的NAFLD细胞模型中也观察到类似的结果。



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图2


要点2:


A-B.油红O(Oil red O,ORO)染色显示,敲低UFBP1导致FFA处理的肝细胞中脂质积累增加,而敲低UFM1没有表现出这种效应。

C.UFBP1的缺失增加了脂肪生成基因固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)、二酰基甘油正酰基转移酶2(DGAT2)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和CD36的mRNA水平。

D.qPCR结果一致,无论是否给予FFA处理,shUFBP1组SREBP1(前驱体和裂解形式)、SCD1、PPARγ和CD36蛋白水平均高于对照组。



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图3


要点3:


A.使用抗FLAG或抗HA M2亲和凝胶对细胞裂解液进行免疫沉淀,以选择性分离UFBP1或UFM1结合蛋白。沉淀蛋白的UFM1和UFBP1免疫印迹中的蛋白条带显示,当Lys267被替换时,UFBP1上的泛素化显著降低。

B.WT UFBP1或UFBP1 K267R恢复UFBP1敲低的L02细胞中UFBP1的表达。在sh UFBP1组中,FFA诱导的脂质蓄积增加被WT UFBP1回调,而UFBP1回调后,FFA诱导的脂质蓄积减少K267R增强了脂质积累。

C.FFA处理的shUFBP1细胞相比,重新表达WT UFBP1也抑制了成脂基因(SREBP1、SCD1、DGAT2、PPARγ、CD36)的转录。反之,重新表达UFBP1 K267R促进SREBP1、SCD1和DGAT2的转录。

D.还观察到WT UFBP1抑制SREBP1(前驱体和裂解形式),SCD1,PPARγ和CD36的表达,而UFBP1 K267R对PPARγ和CD36的表达没有影响,CD36的表达却促进了SREBP1和SCD1的表达。



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图4


要点4:


A.AAV注射后12周,WT UFBP1组小鼠体重显著低于相应的对照组,而UFBP1 K267R组小鼠体重与对照组相比无差异。

B-C.WT UFBP1组小鼠体重的降低归因于附睾脂肪和肝脏重量的降低。然而,与对照组相比,UFBP1 K267R组没有表现出附睾脂肪或肝脏重量的降低。

D.WT UFBP1组的肝脏重量与体重的比值(LW / BW )也低于对照组,而UFBP1 K267R组没有显示出LW/BW的下降。

E.与对照组相比,WT UFBP1组小鼠肝脏颜色红润,体积减小,而UFBP1 K267R组小鼠肝脏无明显改善。

F.此外,ORO和HE染色显示,与对照组相比,在HFD小鼠肝脏中过表达WT UFBP1减少了肝脏脂质积累和肝细胞气球样变。然而,过表达UFBP1 K267R并没有减轻肝细胞气球样变,反而促进了NAFLD肝脏中的脂质积累。

G.此外,与对照组相比,WT UFBP1过表达降低了肝脏TG水平,而UFBP1 K267R过表达没有降低肝脏TG水平。UFBP1 K267R组小鼠肝脏总胆固醇(TC)水平高于对照组,而WT UFBP1组小鼠肝脏TC水平无明显变化。

H.与对照组相比,在NAFLD小鼠肝脏中过表达WT UFBP1也抑制了肝脏中脂肪生成基因(SREBP1、SCD1、DGAT2、PPARγ、CD36)的转录。相反,过表达UFBP1 K267R促进SREBP1、SCD1和DGAT2的转录。

I.此外,与对照组相比,WT UFBP1组肝脏中SREBP1(前体和裂解形式)、SCD1、PPARγ和CD36的蛋白水平降低,而过表达UFBP1 K267R并没有导致PPARγ或CD36的抑制,但导致SREBP1和SCD1的表达增加。



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图5


要点5:


A.ITT结果显示,与对照组相比,WT UFBP1组胰岛素抵抗得到改善。然而,在UFBP1 K267R组中没有观察到改善。

B.GTT结果显示,与对照组相比,WT UFBP1组和UFBP1 K267R组小鼠葡萄糖耐量增加。

C.此外,空腹血清胰岛素水平在UFBP1 K267R组增加,但在WT UFBP1组没有增加。

D.此外,腹腔注射胰岛素后评估肝脏胰岛素信号。通过磷酸化AKT和磷酸化糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)水平的测定,与对照组相比,WT UFBP1组小鼠肝脏中胰岛素信号通路的激活被促进。然而,UFBP1 K267R组肝脏中胰岛素信号通路被抑制。

E.同时,检测了注射后12周各组小鼠血清TG和TC水平。WT UFBP1组血清TG水平低于对照组,而UFBP1 K267R组TG水平与对照组无明显差异。此外,血清TC水平在3组间无显著差异。

F.同时,过表达UFBP1 K267R增加了NAFLD小鼠血清AST水平,而过表达WT UFBP1不影响血清转氨酶水平。



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图6


要点6:


A.FFA处理的敲低UFBP1的L02细胞中,内质网应激相关基因(GRP78、XBP1s、Caspase2)的转录被促进。

B.UFBP1缺失还诱导了内质网应激标志物(PERK、eIF2α、IRE1α)的磷酸化和内质网应激相关蛋白(GRP78,XBP1s,ATF4,ATF6和Caspase2)的表达。

C-D.UFBP1敲低的细胞中重新导入WT UFBP1可以减弱FFA处理下的内质网应激,而在sh UFBP1细胞中重新导入UFBP1 K267R并不能缓解内质网应激。

E.与对照组相比,WT UFBP1组小鼠肝脏中内质网应激相关基因的转录水平降低,而UFBP1 K267R组小鼠肝脏中内质网应激相关基因的转录水平无明显变化。

F.qPCR结果一致,过表达WT UFBP1而非UFBP1 K267R抑制NAFLD肝脏内质网应激标志物的磷酸化和表达。

G.在脂肪变性的肝脏中,UFBP1的泛素化上调,进而缓解肝脏内质网应激。抑制UPR通路(PERK、IRE1α和ATF6通路)抑制肝脏脂肪生成和胰岛素抵抗,导致NAFLD相关表型的缓解。



本文小结:


综上所述,研究表明UFmy1NAFRD中的影响,并探讨其背后的机制。研究NAFLDD患者和NAFLDD模型获得的脂肪变性患者肝脏中UFM1联合蛋白和UFmy1修饰系统组分的表达增加。体外敲除Ufbp1可提高游离脂肪酸(FFA)作用下肝细胞的脂质积累和脂肪生成,野生型Ufbp1可以拯救肝细胞,但主要Ufbp1不存在Uys267(Ufbp1K267R)的突变体Ufbp1不能拯救肝细胞。在体内Ufmy1Ufbp1的应用改善了高脂饮食诱导的小鼠肥胖、肝脂肪变性、肝脂肪生成、血脂障碍、胰岛素抵抗和肝损伤。研究证明Ufbp1诱导的ER压力的下降,Ufbp1的重新引入或过度表达则以依赖于Ufmyd的方式缓解了ER的压力。这一机制有助于改善NAFRD患者的异常肝脂生成和胰岛素抵抗。研究数据揭示了Ufmy1Ufbp1的保护作用,并提供了一个特定的治疗目标。



参考文献:

Mao, Z., Ma, X., Jing, Y. et al. Ufmylation on UFBP1 alleviates non-alcoholic fatty liver disease by modulating hepatic endoplasmic reticulum stress. Cell Death Dis 14, 584 (2023).

https://doi.org/10.1038/s41419-023-06095-2




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