IF64.8 Nature│DNA损伤诱导的CTBP1-DT lncRNA编码的DDUP蛋白在卵巢癌中导致顺铂耐药前言： 2023年8月26日，江门市中心医院临床实验中心、江门市临床生物库与转化研究重点实验室、中山医学院生物化学系等多个实验室联合在Nature发表题为“The DDUP protein encoded by the DNA damage-induced CTBP1-DT lncRNA confers cisplatin resistance in ovarian cancer”的研究论文，研究发现DDUP介导的异常DDR信号在顺铂抗性中的作用，并描述了一种潜在的治疗顺铂耐药性卵巢癌的新方法。
背景介绍： 卵巢癌是全球最致命的妇科恶性肿瘤之一，60%~75%的卵巢癌患者就诊时已处于晚期。尽管在过去的几十年中，卵巢癌的治疗取得了很大的进展，但卵巢癌患者的预后仍然很差，总体5年生存率约为40%。卵巢癌的不良预后主要归因于对以铂类为基础的化疗的耐药，而铂类化疗是卵巢癌的标准化疗方案。尽管约80%的卵巢癌患者对铂类化疗药物敏感，但仍有近25%的卵巢癌患者在接受铂类治疗的6个月内复发，约75%的患者在2年后复发。因此，了解铂类化疗耐药的机制将有助于开发新的卵巢癌治疗策略。铂类化疗药物通常会引起基因组DNA的严重改变，包括DNA单链断裂和双链断裂，从而改变DNA的结构，并可能导致细胞损伤和细胞凋亡。细胞已发展出多种DNA损伤应答(DDR)机制，以便及时修复受损的DNA。细胞快速招募一些蛋白质到受损DNA周围的染色质位点来启动DDR，从而协调DNA损伤信号的检测、维持和修复。 图文解析：
图1 要点1： a-b.与CTBP1-DT lncRNA低表达的患者相比，CTBP1-DT lncRNA高表达的卵巢癌、肺癌和胃癌患者的总生存期和无进展生存期显著缩短。在接受铂类化疗的卵巢癌患者中，CTBP1-DT lncRNA的表达与较短的无进展生存期和总生存期呈负相关。 c.无应答组DDUP的表达显著高于应答组。
图2 要点2： a.人类基因CTBP1-DT位于染色体Chr 4p16.3(1,243,228-1,246,795)，其转录本lncRNA CTBP1-DT(NR_033339.1)包含2个外显子。DDUP蛋白的开放阅读框(ORF)为561bp，位于lncRNA的第2外显子CTBP1-DT，编码186个氨基酸的蛋白(分子量:19.74kDa)。 b-c.CTBP1-DT lncRNA在CDDP耐药的PDOVCs#3和PDOVCs#4中的表达显著高于CDDP敏感的PDOVCs#1和PDOVCs#2。免疫印迹分析结果表明，在没有CDDP处理的情况下，DDUP在所有4个PDOVCs中都不表达。然而，CDDP处理能显著诱导4种PDOVCs中DDUP蛋白的表达，且CDDP耐药的PDOVCs#3和PDOVCs#4中DDUP的水平高于PDOVCs#1和PDOVCs#2。 d.为了进一步确定DDUP蛋白或编码CTBP1-DT lncRNA的宿主基因对CDDP耐药的影响，研究人员构建了一系列表达或不表达DDUP蛋白的CTBP1-DT lncRNA质粒。 e.通过Flag抗体的免疫荧光染色发现，转染DDUP、CTBP1-DT和CTBP1-DT/ATG2m的PDOVCs在无CDDP处理的情况下，Flag标记的DDUP在细胞核中表达，而在有CDDP处理的情况下，Flag标记的DDUP在细胞核中不表达。转染DDUP、CTBP1-DT和CTBP1-DT/ATG2m的PDOVCs#1和PDOVCs#2对CDDP处理有明显的DDUP灶。 f-g.通过中性彗星实验以及γ-H2AX免疫荧光实验分析，ATG2m不仅降低了CDDP诱导的DNA交联，而且降低了CDDP诱导的DNA损伤。然而，在转染CTBP1-DT/ATG1m和CTBP1-DT/ATG1/2m的PDOVCs#1和PDOVCs#2中，CDDP诱导的DNA损伤水平几乎相同。 i.转染PDOVCs#1和PDOVCs#2的细胞凋亡率增加。DDUP、CTBP1-DT或CTBP1-DT/ATG2m处理后CDDP明显低于对照组细胞；然而，转染CTBP1-siRNA的PDOVCs的凋亡率降低。 j.异位表达DDUP的CTBP1-DT结构显著增加了CDDP处理后的细胞存活率，而不编码DDUP的结构没有增加细胞存活率。
图3 要点3： a-b.实时定量PCR实验结果表明，CTBP1-DT lncRNA在DDUP-/-PDOVCs #3和PDOVCs#4在CDDP处理后与对照细胞相当；然而，处理CDDP不能增加DDUP-/-细胞中DDUP蛋白的表达。IB研究显示的PDOVCs#3和PDOVCs#4。这些结果表明了该系统的成功建立Ddup-/- PDOVCs#3和PDOVCs#4。 c.γ-H2A焦点染色显示，PDOVCs#3和PDOVCs#4明显高于对照细胞。 d-e.CDDP处理后，PDOVCs#3和PDOVCs#4显著高于对照细胞。细胞活力分析结果进一步证明，DDUP抑制了DDUP-/- PDOVCs#3和PDOVCs#4对CDDP的耐药性，表现为细胞数量的显著减少。总之，这些结果表明DDUP对CDDP治疗敏感。
图4 要点4： a.IF染色结果显示，在未用CDDP处理的PDOVCs中检测不到内源性DDUP蛋白；然而，CDDP处理显著诱导了DDUP的表达和DDUP灶的形成。 b.与对照细胞相比，PDOVCs#3和PDOVCs#4中的DDUP KO显著增加了GFP-RAD18焦点的信号恢复率(约56%)，其恢复率约为23%。然而，DDUP过表达显著降低了PDOVCs#1和PDOVCs# 2中GFP-RAD18焦点的信号恢复率。 c-d.在对照组和DDUP-KO细胞中，DNA损伤诱导的RAD18和RAD51C焦点在CDDP处理后1h左右同时出现。这些结果表明，DDUP不参与DNA损伤诱导的RAD18和RAD51C焦点的形成。然而，在DDUP-KO细胞中，RAD18和RAD51C焦点在不到10h内迅速消失并达到本底水平，而对照细胞中RAD18和RAD51C焦点的峰值在大约24h后缓慢消失并达到本底水平。 e.在CDDP处理的DDUP-KO细胞中迅速消失的PCNA焦点也观察到类似的模式。
图5 要点5： a.CDDP(12.3μM)与Bezosertib(80nM)联合使用对DDUP高表达的PDOVC#3(CI=0.471)和PDOVC#4(CI=0.475)。因此，后续研究采用CDDP(12.3μM)联合Bezosertib(80nM)进行治疗。 b-c.在DDUP表达水平较低的PDOVCs#1和PDOVCs#2中过表达DDUP，显著降低了CDDP处理后γ-H2AX的诱导。这些研究结果进一步证实了上述作用DNA损伤修复中的DDUP。然而，联合治疗与Berzosertib和CDDP在DDUP过表达细胞或DDUP高表达细胞中显著取消了DDUP上调对CDDP诱导γ-H2AX的抑制作用。 d-e.碱性变性和中性彗星实验表明，与单独使用CDDP处理的细胞相比，CDDP和Berzosertib共处理增加了CDDP诱导的DNA交联和DDUP过表达细胞中的DNA损伤。 f-g.CDDP和Berzosertib共处理导致DDUP高表达的PDOVCs#3和PDOVCs#4与CDDP单独处理的细胞相比，DNA交联或DNA损伤水平增加。 h.与CDDP单药相比，CDDP/Berzosertib联合治疗显著增加了细胞的凋亡率表达高水平DDUP的PDOVCs#3和PDOVCs#4。
图6 要点6： a-b.过表达DDUP/WT的肿瘤对卡铂治疗表现出更高的耐药性，表现为肿瘤体积增大，Ki-67指数升高，γ-H2AX和β-H2AX降低TUNEL信号。然而，Berzosertib几乎消除了DDUP过表达诱导的强烈卡铂耐药性。转染DDUP/PDOVCs#1形成的肿瘤。T174D对卡铂单药治疗和卡铂/Berzosertib联合治疗均表现出较高的耐药性。
图7 要点7： a.使用两种临床卵巢癌组织(PDOVC-#3和PDOVC-#4)建立的体内患者来源的异种移植(PDX)模型检测了卡铂/Berzosertib联合治疗对卵巢癌的治疗效果。PDOVC-#4，其在DNA损伤后表现出更高的DDUP表达。 b-e.PDOVC-#3/PDX和PDOVC-#4/PDX对卡铂治疗表现出明显的耐药性，肿瘤体积和中位总生存期与对照组相似。然而，卡铂/Berzosertib联合治疗显著降低了PDOVC-#3/PDX和PDOVC-#4/PDX小鼠的肿瘤体积，具有较高的γ-H2AX和凋亡指数，但Ki-67指数较低。 f-g.PDOVC-#3/PDX和PDOVC-#4/PDX小鼠的中位总生存期显著高于接受卡铂或Berzosertib单药治疗的小鼠。
图8 要点8： 铂类化疗药物与ATR抑制剂的联合使用改善了卵巢癌模型的治疗效果，并可能成为克服卵巢癌临床复发的潜在新策略。 本文小结： 综上所述，研究人员观察到DDUP的表达在CDDP耐药的卵巢癌细胞中显著上调，并且DDUP高表达的患者在铂类为基础的化疗后总生存期和无病生存期较短，而DDUP低表达的患者预后较好。进一步证明了与ATR抑制剂Berzosertib的联合治疗，可显著促进卵巢癌细胞对CDDP耐药的敏感性。因此，本研究为lncRNA介导的CDDP耐药提供了进一步的证据，并描述了卵巢癌中诱导CDDP耐药的新机制。 参考文献： Ren, L., Qing, X., Wei, J. et al. The DDUP protein encoded by the DNA damage-induced CTBP1-DT lncRNA confers cisplatin resistance in ovarian cancer. Cell Death Dis 14, 568 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-06084-5 |
