IF30.5 Nature Immunology|肿瘤抗原的早期数小时接触决定CD8+T细胞衰竭命运

前言：

2023年8月3日，Mary Philip博士团队在Nature Immunology在线发表发表题为“Hallmarks of CD8⁺ T cell dysfunction are established within hours of tumor antigen encounter before cell division ”的研究性论文。研究揭示了在肿瘤与感染的关系中,T细胞选择在细胞分裂之前的快速分化。

背景介绍：

肿瘤特异性CD8⁺ T细胞(TST)在癌症患者中功能失调，无法阻止癌症进展。TST功能障碍，也被称为衰竭，被认为是由数天至数周的慢性T细胞抗原受体(TCR)刺激引起的。然而，对CD8⁺ T细胞功能、细胞分裂和激活后数小时内的表观遗传重塑之间的相互作用知之甚少。

图文解析：

图1

要点1：

a.为了确定增殖与分化到功能或功能失调状态之间的关系，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记SV40 T细胞抗原(TAG)特异性CD8⁺ T细胞(T细胞抗原受体(TCR)_TAG)，允许细胞分裂跟踪，并将其转移到标签驱动的肝肿瘤(ASTxAlb-Cre)小鼠中。或转入表达TAG表位的单核增生李斯特菌(LM_TAG)感染的C57BL/6小鼠。

b.分析了转移后12、36、48和60h的TCR_TAG，以捕获处于分裂各个阶段的T细胞。c.荷瘤宿主(T)和感染宿主(E)中的T细胞都经历了非常强劲的细胞分裂(60小时内分裂6个以上)，扩展和上调活化标记CD69和CD44。E-TCR_TAG和T-TCR_TAG均上调LAG3和PD-1;反映主动TCR信号。

d-e.T-TCR_TAG在ASTxAlb-Cre宿主的肿瘤、肿瘤引流淋巴结和脾脏中也表现出类似的增殖和免疫表型变化。令人惊讶的是，尽管有强大的激活和增殖，T-TCR_TAG在体外完全不能产生IFN-γ和TNF，以响应TAG肽的再刺激。这与感染小鼠肝脏或脾脏的E-TCR_TAG形成鲜明对比，后者产生效应细胞因子(IFN-γ/TNF)和细胞溶解分子(GZMB/PRF1)，并且能够在少数细胞分裂中脱颗粒(CD107a膜定位)。因此，肿瘤抗原遭遇驱动CD8⁺ T细胞活化和增殖，而不获得效应功能。

图2

要点2：

a.肿瘤特异性T细胞效应功能损伤始于细胞分裂前鉴于TST效应功能损伤在少数细胞分裂中很明显，接下来评估了细胞分裂前(6小时，12小时，18小时)。

b.T-TCR_TAG在6小时内被激活，其动力学与感染小鼠相似，可以通过CD69诱导和CD44、LAG3和PD-1的上调来证明。

c-d.虽然E-TCR_TAG在这些早期时间点产生效应细胞因子，但T-TCR_TAG在6小时内显示TNF的丢失和诱导IFN-γ的失败，并且在12小时内几乎完全无法产生这两种细胞因子。T-TCR_TAG也不能产生GZMB。因此，与感染激活的T细胞相比，TST中效应功能的多个臂在激活后数小时内受损。

e.有趣的是，与肿瘤功能障碍和慢性病毒感染衰竭相关的DNA结合蛋白TOX在这些早期时间点未被诱导，这证实了TOX不介导效应功能损伤。

图3

要点3：

为了排除肿瘤的快速功能障碍仅仅是由于启动不足造成的可能性，测试了是否为合作性效应子T细胞会屈服于肿瘤诱导的功能障碍，其动力学与初始T细胞相似。

a.将CFSE标记的第5天效应分子TCR_TAG(E5d)从LMTAG感染的B6小鼠中过继转移到荷瘤小鼠体内ASTxAlb-Cre(E → T)小鼠或时间匹配的LMTAG感染B6(E → E)小鼠，分析12 h，36 h和7 d后。

b-d.E → E重新表达CD127(IL7R)，并在二次受者的肝脏和脾脏中保持IFN-γ/TNF双生产者，表明E5d是执行记忆分化的功能效应器，并且不受运输到肝脏微环境的负面影响。相比之下，E → T在转移后增殖，但在12 h内开始丧失细胞因子生产能力，至7 d完全丧失。E → T表现出经典的功能障碍或衰竭的分层进展，首先是TNF的丢失，其次是IFN-γ。值得注意的是，几乎所有的效应子功能丧失都发生在细胞分裂之前，再次证明了效应子功能的丧失并不需要细胞分裂。

图4

要点4：

为了验证TST效应功能的快速丧失是否也发生在其他具有不同抗原特异性的癌症类型/组织中，采用了肺黑色素瘤转移模型。

a.通过静脉注射表达CD8⁺T细胞识别的卵清蛋白_257-264表位与EGFP(B16-ova)融合的B16小鼠黑色素瘤细胞，在B6小鼠中诱导转移。将未成熟的ova特异性TCR转基因CD8⁺ T细胞(TCR_OTI)过性转移到携带B16-ova或lmova感染的B6中，并在16h和48h后进行分析。CD69和PD-1证明T-TCR_OTI和E-TCR_OTI被快速激活第一次细胞分裂前的诱导。

b.48h时，T-TCROTI和E-TCR_OTI均强劲增殖并上调CD44和LAG3。

c-d.尽管有增殖，T-TCR_OTI不能产生TNF和IFN-γ，仅产生少量GZMB。与此形成鲜明对比的是，E-TCR_OTI在激活16小时后产生TNF、IFN-γ和GZMB，并且随着时间的推移功能增强。接下来，测试了ova特异性效应T细胞是否会在肺黑色素瘤转移的宿主中失去功能。

e.从lmova感染的B6小鼠中过继转移CFSE标记的第5天效应物TCR_OTI(E5d)，并将其过继转移到时间匹配的lmova感染小鼠(E→E)或肺B16-OVA转移的B6小鼠(E→T)。

f-g.在转移后的24小时内，当大多数群体尚未分裂时，E→T-TCR_OTI开始失去产生TNF和IFN-γ的能力，与E→E-TCR_OTI相反，E→E-TCR_OTI仍然保持高度功能。这些发现表明，快速发作的TST功能障碍并不局限于肝脏微环境或肝脏但可以发生在不同组织的其他晚期癌症中，具有不同的肿瘤类型和抗原特异性。

图5

要点5：

在TST中发现的分裂前功能障碍导致研究人员提出疑问，功能障碍相关的表观遗传重塑是否也发生在细胞分裂之前。

a.将CFSE标记的TCR_TAG转移到荷瘤小鼠体内ASTxAlb-Cre或LM_TAG感染的B6小鼠，分选出预分裂的T-TCR_TAG(从6 h、12 h和24 h的肝脏肿瘤中分离出)和E-TCR_TAG(在6 h、12 h和24 h从脾脏中提取)，通过转座酶可及染色质测序(ATAC-seq)和RNA测序(RNA-seq)基因表达评估染色质可及性。

b-c.ATAC-seq和RNA-seq数据的主成分分析(PCA)显示，在6h内，T-TCR_TAG和E-TCR_TAG具有不同的染色质可及性和基因表达谱。引人注目的是，在激活后的前6小时发生了最多的染色质重塑变化，在12小时和24小时发生的变化较少。

d.64%的差异可达染色质峰(DACs)在E-TCR_TAG和T-TCR_TAG之间共享，包括TCR信号下游基因(Irf4,Nfatc2,Nfkb1,Lat)。值得注意的是，与E-TCR_TAG相比，T-TCR_TAG中大量的峰更容易被差异访问(21%)。Pdcd1在转录起始位点(-23-kb)上游23kb处包含一个增强子峰，先前显示在肿瘤中功能失调/耗尽的T细胞中优先打开和慢性病毒感染期间。值得注意的是，发现在肿瘤T细胞激活后6小时内更容易获得-23kb“耗尽”相关的Pdcd1峰。为了确定驱动早期染色质重塑差异的潜在TF，使用ChromVar25对E6-24小时和T6-24小时之间的DAC进行基序分析。

e.与炎症细胞因子诱导的TF相关的基序，如STAT家族成员，在早期E-TCR_TAG DAC中优先富集，这与李斯特菌诱导的先天免疫激活一致。通过RNA-seq检测表达情况发现，与T-TCR_TAG相比，E-TCR_TAG中含有STAT1基序的差异表达基因(DEG)较多，且基因表达变化主要与峰值变化方向相关(Extended Data)。含有STAT1基序峰的上调基因编码细胞因子受体，如Il12rb和炎症相关基因，如Oasl1。另一方面，在TST中，NFAT TF家族基元在DAC中富集。之前的研究表明，NFAT在较晚的时间点驱动TST中多种抑制受体和TF TOX17的表达。因此，与急性感染中的T细胞相比，TST中NFAT活性的改变始于激活后数小时内，可能是由于NFAT与不同TF伴侣或基因组位置的关联。基因集富集分析(GSEA)显示，与初始TCRTAG相比，感染小鼠和荷瘤小鼠中早期激活的TCRTAG共享与T细胞活化相关的基因富集。

f.T-TCR_TAG和E-TCR_TAG也共享嘌呤/嘧啶代谢、MYC靶点、翻译、糖酵解和氧化磷酸化相关的基因集富集，已知TCR激活后会诱导这些基因集。将T-TCR_TAG和E-TCR_TAG进行对比时，发现早期E-TCR_TAG富集了与IFN-α和IFN-γ反应相关的基因集，这与DAC中STAT TF基序富集一致。

f.相反，在没有信号或炎症刺激的T细胞中表达的基因组中，早期T-TCR_TAG富集。这些分析表明，在感染宿主和荷瘤宿主中激活的T细胞受到类似的TCR刺激;然而，在荷瘤宿主中激活的T细胞无法接收感染宿主中存在的炎症细胞因子信号。接下来，分裂前感染和肿瘤激活的TCR_TAG转录谱如何与稍后时间点的T细胞谱进行比较。早期E-TCR_TAG显示与急性感染的后期效应T细胞(第6天)和记忆T细胞(第30天)相关的基因集富集。相反，早期T-TCR_TAG显示肿瘤(第5-30天)或慢性病毒感染(第30天)中与后期功能失调/耗尽T细胞相关的基因组富集)。

g.与这些发现一致，T-TCR_TAG诱导T细胞功能负调控因子(Rgs16、Pdcd1、Ptpn22)的表达增加，炎症相关基因(Mx1、Isg15)、编码细胞因子/细胞溶解介质的基因(Ifng、Gzmb、Gzma)和编码功能分化相关TF的基因(Batf、Tbx21)的表达降低。T-TCR_TAG表达更多的Bach2和Id3，之前与记忆表型和效应分化抑制有关。综上所述，数据表明，之前与晚期功能失调或耗竭T细胞相关的表观遗传和转录变化已经在肿瘤宿主中激活数小时内被诱导。

图6

要点6：

接下来研究分裂前功能障碍相关的染色质可及性变化是否会随着时间和持续的抗原暴露而维持或演变。

a.比较了T6h-T24h的染色质可及性之前发表的5-60d后从肝脏肿瘤中分离的TCR_TAG的染色质可及性数据。在5d(T5d)和10d(T10d)后对从ASTxAlb-Cre中分选的TCRTAG进行了ATAC-seq。PCA显示，TST染色质可及性根据肿瘤暴露时间分为早期(6-24h)、中期(5-10d)和晚期(14-60d)三组)。b.肝恶性病变T5d与TST中经历第三波染色质重塑的肿瘤(可能是由持续的肿瘤抗原暴露驱动的)相比，E5d后很少出现峰值变化，表明记忆相关的染色质状态在病原体/抗原清除后的第5天就基本建立起来了。c-d.接下来，通过绘制每个峰的可达性在早期过渡(初始(N)至6h)与中间(int)过渡(24h至5d)期间的折叠变化来比较个体DAC随时间的变化。分析显示，随着肿瘤/抗原的持续暴露，TST中36%的分裂前重构染色质峰保持稳定(19%闭合，17%打开)，其他峰随着时间的推移而增强(13%)或在中间过渡时开放(16%)。因此，近50%(稳定+增强)的T5d染色质可及性特征在肿瘤激活后的前6小时内已经建立。这与感染期间的分化形成鲜明对比，其中许多早期DAC是短暂的(51%)或在24小时至5天之间新发生(19%)。虽然肿瘤激活和感染激活的T细胞在中后期(T14d或M)过渡期间经历了一些染色质重塑，但大多数染色质可及性变化(>60%)保持稳定。

e-f.Pdcd1基因座体现了这些模式，随着时间的推移，峰值变化在肿瘤中保持并加强，在急性感染诱导的效应/记忆分化期间短暂，与PD-1表面表达一致。功能障碍/耗竭相关的-23-kb Pdcd1增强子峰仅在肿瘤中早期开放，并在较晚的时间点增强，而+4.5kb的峰在感染期间短暂开放，在肿瘤中保持稳定开放，+10kb的峰仅在肿瘤的中间时间点开放(int open)。

g.为了确定在效应体和TST分化过程中驱动特定过渡峰变化的潜在tf，使用Lisa(monaLisa)进行了MOtif aNAlysis。虽然E-TCR_TAG和T-TCR_TAG在瞬时开放峰(浅紫色)中的TF富集总体上相似，但NFAT TF家族基基在肿瘤中具有增强(浅橙色)和后期/中间(深橙色)开放的峰中特别富集，但在感染期间却没有，这与TCR_TAG在肿瘤中接受持续的抗原/TCR刺激而在急性感染期间仅接受短暂刺激一致。相比之下，T-box TF家族基元，包括TBET (TBX21)和EOMES的基元，在早期开放的峰中更丰富，并且在感染期间主要增强(浅橙色)，但在肿瘤中则较少，这与这些TF在急性感染期间促进功能效应形成和病原体/抗原清除后功能记忆群体中的作用一致。

图7

要点7：

a.取诱发肿瘤后1、5和10天（T24h、T5d和T10d）的肝癌小鼠模型的T细胞，并注射至无瘤小鼠，停留1、5和10天（P24h、P5d和P10d）再取出。b.结果发现，直接从肝癌模型小鼠取出的T细胞不能产生细胞因子。

c.在无瘤小鼠体内停留1至5天后，PD-1表达持续下调，

b-d.但仍有近三分之一的细胞不能产生TNF或IFN-γ。随着肿瘤抗原刺激时间的延长，为更多的T细胞打上了“印记”，其效应功能的丧失，几乎所有的T10d都不能产生细胞因子，PD-1持续高表达。

e-f.评估染色质可及性时，本研究发现：无瘤小鼠体内停留前后的记忆T细胞聚类存在差异。

g.本研究继续使用类似于图6c所描述的散点图分析，表征停留前后DAC变化。T24h许多峰变化都较短暂，P5d后恢复，稳定的峰较少。然而，随肿瘤刺激时间的延长，瞬时峰的数量减少，稳定峰的数量增加。相应地，随着肿瘤暴露时间的延长，停留后T细胞的Pdcd1增强子的染色质可及性增加。相比之下，停留后T细胞的TOX表达持续丢失，这表明TOX表达依赖于更长时间的抗原刺激。T细胞逐渐丧失功能的印记是由谁烙上的呢？本研究探讨了转录因子的基序富集在停留前后DACs的变化。

h.停留后，开放染色质峰显示CTCF基序富集。近有研究表明，CTCF介导的基因组重组可促进CD8⁺T细胞效应分子的分化。NFAT转录因子家族富集在中期增加，在肿瘤切除后丢失，表明NFAT介导的DACs需要持续的TCR信号维持。停留后的样本更接近记忆性T细胞，而两者都不再受到抗原刺激。然而，抗原再刺激时，记忆性T细胞能够产生高水平的TNF和IFN-γ，停留后的T细胞则丧失了产生细胞因子的功能。i.记忆性T细胞富集了记忆性相关的TCF1和ZEB家族基序，而P5d缺乏此类富集。

本文小结：

综上所述，研究表明,有两个主要因素导致TST功能障碍的宿主晚期肿瘤。由肿瘤引起的T细胞功能障碍需要在几天到几周的时间里对抗原进行慢性刺激的模式,相反地表明CD8⁺在不同的环境中,T细胞在激活后立即整合多个信号输入(TCR、共同刺激/抑制和细胞因子),这决定了它们的基因编码分化对功能效应状态(感染)或功能失调状态(肿瘤)的影响。通过解读由TCR和背景相关输入驱动的复杂的信号和基因调控网络网络,为将来设计出更好的策略来改变T细胞或将其重新定位为功能性癌症杀手。

参考文献：

Rudloff, M.W., Zumbo, P., Favret, N.R. et al. Hallmarks of CD8+ T cell dysfunction are established within hours of tumor antigen encounter before cell division. Nat Immunol 24, 1527–1539 (2023). https://doi.org/10.1038/s41590-023-01578-y