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IF16.6 Nature Communications│组蛋白H3第57位丝氨酸是CHK1的底物,其磷酸化影响DNA修复

前言:


2023年8月22日,法国蒙彼利埃大学的Daniel Fisher教授团队在Nature Communications上发表了题为“Histone H3 serine-57 is a CHK1 substrate whose phosphorylation affects DNA repair”的研究论文,揭示了H3S57的动态磷酸化是DNA修复和从复制应激中恢复所必需的,为研究这种修饰在其他DNA相关过程中的作用开辟了途径。


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背景介绍:


DNA复制点的持续性受到多种机制的阻碍,包括核苷酸耗竭、DNA损伤或内源性难以复制的序列,统称为复制应激。这是癌细胞促进染色体不稳定性的一个标志,通过导致停滞的复制点崩溃和DNA双链断裂(DSB)的形成,毒性染色体损伤必须修复,以避免染色体丢失和维持细胞活力。这些不同的DNA修复途径的使用受到组蛋白翻译后修饰(PTMs)的影响。研究人员利用多学科方法研究了其调控和功能,包括蛋白质组学、哺乳动物培养细胞实验、全基因组筛选、体外实验、裂殖酵母和出芽酵母遗传学以及全原子分子动力学模拟。


图文解析:


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图1


要点1:

a.研究人员鉴定了一个组蛋白H3的磷酸化肽段Ser-57,一个保守的氨基酸位于DNA的出/入口点的核小体上。

b.H3S57ph抗体在XEE的染色质免疫印迹上检测到一条15 kDa的(组蛋白H3的大小)条带,该条带在lambda磷酸酶处理后丢失。

c.H3S57ph含量丰富的U2OS细胞中,两种条带均存在于细胞核提取物、酸提取的组蛋白制剂或微球菌核酸酶消化的染色质中;盐提取表明H3S57ph主要存在于单核小体中。同样,用商品化的H3K56ac抗体观察到两条条带,研究人员对其特异性进行了验证。各条带的水平在不同的癌细胞系之间存在差异,而研究人员只在未转化的视网膜色素上皮(RPE)细胞中检测到低水平的H3S57ph。这种H3S57ph水平的变化表明,在大多数细胞系中,该标记不是组成性地存在于所有核小体上,而是在复制应激较高的癌细胞中升高。

d.与此结论一致的是,H3c-末端、H3K56ac和H3cs.1尾部裂解特异性抗体也鉴定到了迁移较快的条带,而针对组蛋白N-末端修饰的抗体没有鉴定到,这表明较低的条带已经失去了N-末端尾巴。

e.为了支持这个假设,在胰蛋白酶控制的体外切割组蛋白提取物后,只剩下一个单一的、迁移速度较快的种属。总的来说,这些数据表明他们的抗体特异性地检测H3S57ph作为全长和无尾H3的PTM。



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图2


要点2:


a-b.研究人员想知道H3S57ph是否是一个细胞周期调控的标志。研究人员通过免疫荧光观察到大量H3S57ph的核焦点,其强度随着细胞进入G2期而增加,与细胞周期中H3丰度的增加相一致。

c.为了检测这一点,研究人员用噻氨酯哒唑同步有丝分裂期的细胞,或用胸苷同步S期早期的细胞,并将它们从块中释放出来。

d.噻氨酯哒唑阻断有丝分裂的细胞H3S10磷酸化较高,与预期一致,但H3S57ph水平较低。这证实了研究人员的抗体不与H3S10磷酸化发生交叉反应,并表明在有丝分裂中H3S57ph水平较低。相反,被双胸腺嘧啶核苷阻滞在早期S期的细胞显示出丰富的H3S57ph,其在阻滞释放后减少,然后在复制时再次增加。

e.这些数据表明,H3S57ph可能在复制点通过后被整合到新形成的染色质中,并在复制停滞时升高。通过分离新生DNA(iPOND42)上的蛋白质,研究人员证实了这一点。然而,与PCNA特异性识别复制点不同的是,H3S57ph在胸腺嘧啶核苷追逐后在iPOND上减少,进一步增加。因此,与酵母中的H3K56ac相反,H3S57ph并不是在复制点周围短暂存在的。



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图3


要点3:


a.研究人员以190个Ser/Thr人类激酶和H351-72肽作为底物进行体外实验来筛选候选物。在对该底物具有高活性的4个激酶中,DNA损伤应答激酶CHK1是唯一组成型表达的核激酶。

b.首先,通过33P放射性磷酸盐掺入的定量检测,纯化的重组CHK1在体外能有效磷酸化H3S57肽段,而不受K56乙酰化的影响,但并不是在S57上已经磷酸化的类似肽段。

c-d.这说明S57是该肽段上唯一的CHK1位点,即苏氨酸-58不是靶点。此外,根据研究人员的H3S57ph抗体表位的出现情况,CHK1也可以磷酸化全长重组组蛋白H3的第57位丝氨酸。

e-i.在每种情况下,这些处理都强烈地降低了H3S57ph的水平。短时间的CHK1抑制剂处理后,H3S57ph的丢失发生在没有S期阻滞的情况下,表明S57ph是一个动态的修饰。从长期来看,在U2OS细胞中敲低CHK1增加了S期细胞比例,而在XEE和同步化的U2OS细胞中,CHK1的抑制阻止了DNA复制的完成。总的来说,这些结果确定了CHK1是人类细胞中H3S57激酶的最可能的候选者。



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图4


要点4:


a.在稳定表达这些等位基因的U2OS克隆中,WT H3引起细胞增殖的轻微下降,正如预期的那样。H3S57D细胞具有相似但加剧的表型,相反,H3S57A加速细胞增殖。

b.H3S57A的表达也加快了HU介导的阻滞释放后进入S期的进程。这表明H3S57的磷酸化可能会促进对复制应激反应的较慢途径,而组成性模拟H3S57磷酸化的组蛋白的过表达似乎具有毒性。

c.正如预期的那样,过表达WT H3导致自发的DNA损伤,8%的细胞γH2A阳性。X.H3S57D表现出类似的表型,暗示H3S57D并不通过进一步增加DNA损伤而阻碍细胞增殖。相反,过表达H3S57A的细胞并没有表现出γH2A的增加。X.HU处理引起显著的γH2A。无论H3过表达与否,约半数细胞X染色阳性。外源性WT H3或H3 S57D在去除HU后恢复减慢,而在S57A突变细胞中,恢复加快。这些结果表明,S57磷酸化可能对DNA修复途径产生不同的影响。

d.过表达WT H3或H3S57D的HU处理的细胞比没有外源组蛋白表达的细胞显示出更少的ssDNA,尽管DNA损伤程度相似,而表达H3S57A的细胞中含有ssDNA的比例接近对照组。

e.与表达WT H3的细胞相比,表达H3S57A的细胞在HU处理后表现出更高的53BP1水平;相反,具有H3S57D的细胞中53BP1染色较高的细胞较少。

f.研究人员观察到RAD52的缺失引发了H3S57A表达细胞的自发性DNA损伤,并导致HU处理后更高的DNA损伤水平。此外,在没有外源组蛋白表达的细胞或表达H3S57A的细胞中,敲低RAD52对HU的恢复几乎没有影响,但在表达WT H3或H3S57D的细胞中,HU的恢复加快。这表明S57磷酸化促进缓慢的RAD52依赖的修复,可能是SSA,而减少这种修饰通过更快的53BP1依赖的机制刺激修复。



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图5


要点5:


a-b.与出芽酵母一样,研究人员的H3S57ph抗体以磷酸化依赖的方式在WT裂殖酵母细胞的提取物中检测到了清晰的信号,但在只表达H3S57A的细胞提取物中只观察到了背景染色。

c.重要的是,H3S57A和H3S57D细胞对MMS、喜树碱(CPT)和HU敏感,进一步支持了H3S57ph在复制应激反应中的作用。

d.研究人员发现在没有复制应激诱导剂的情况下,含有H3S57D的裂殖酵母表现出5倍的细胞数量增加,细胞中出现>2个或更多的异常Rad52焦点,而H3S57A表现出更小的缺陷。

e.研究人员通过比较WT细胞与缺乏NHEJ所必需的DNA连接酶4(lig4)或HR所必需的Rad52的细胞来验证这些检测方法的特异性。研究人员的研究结果表明,H3S57D显著降低了NHEJ和HR。令人惊讶的是,由于H3S57A突变体对复制应激诱导剂的敏感性相对适中,它们几乎完全取消了使用NHEJ或HR的修复。这些发现揭示了H3S57ph在裂殖酵母NHEJ和HR中的关键作用,并强调了这种修饰在DNA修复中的潜在重要性。



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图6


要点6:


a.研究人员发现,有或没有磷酸化的核小体都是稳定的,并且从共同的初始结构5.1 '和2.4 '显示出RMSD,迁移率集中在H3的固有无序尾部。H3S57ph核小体较高的RMSD主要是由于N端发生了构象变化,形成了两个新的短螺旋,而核小体蛋白核在亚微秒时间尺度上没有明显的结构畸变。

b-c.研究人员还观察到与H3尾部接触的核小体出/入口位点的DNA残基(133-163)的RMSD值系统性地更高。因此,失去了两个H3-DNA氢键稳定的相互作用,而S57ph部分地隔离了R53和K56,从而降低了组蛋白H3与出/入口点的DNA骨架之间的静电吸引力。这将导致染色质更容易接近,并可能阻碍K56乙酰化。

d.因此,研究人员使用合成的组蛋白H3蛋白进行体外乙酰化检测,其中S57被磷酸化或不被磷酸化。事实上,正如预测的那样,CPB对K56的乙酰化作用被H3S57ph强烈地降低了。

e.在核小体定位不受全局影响的情况下,与WT和H3S57A突变体相比,H3S57E突变体中亚核小体片段(<147 bp)的数量显著增加。



本文小结:


综上所述,H3S57ph是一个组成型标记,在DNA损伤时不被诱导。因此,H3S57ph与H3K56ac类似,可能影响DNA修复之外的多个DNA代谢过程,如促进核小体组装,促进转录的起始和延伸步骤。



参考文献:

Parisis, N., Dans, P.D., Jbara, M. et al. Histone H3 serine-57 is a CHK1 substrate whose phosphorylation affects DNA repair. Nat Commun 14, 5104 (2023).

https://doi.org/10.1038/s41467-023-40843-4

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