IF13.2EmergingMicrobes&Infections│通过单细胞RNA测序分析BBIBP-CorV灭活SARS-CoV-2疫苗健康受者外周血免疫细胞的细胞和分子变异特征前言： 2023年5月9日，上海交通大学医学院附属仁济医院心内科，上海免疫治疗研究所等多个实验室联合在EmergingMicrobes&Infections发表题为“CharacterizingthecellularandmolecularvariabilitiesofperipheralimmunecellsinhealthyrecipientsofBBIBP-CorVinactivatedSARS-CoV-2vaccinebysingle-cellRNAsequencing”的研究论文。研究发现，单细胞TCR-seq和RNA-seq联合分析鉴定了加强免疫后CD4+T细胞的克隆性扩增，这与记忆CD4+T细胞和2型辅助性T细胞的TCR多样性降低相对应。
背景介绍： 单细胞RNA测序(scRNA-seq)和单细胞T细胞受体(TCR)/B细胞受体(BCR)测序(scTCR/BCR-seq)技术在单细胞水平的细胞生物学研究中具有强大的功能。新型冠状病毒肺炎(COVID-19)最近的大流行促使人们需要单细胞研究来揭示不同免疫细胞在症状发展过程中的免疫应答特征。最近的研究在单细胞水平上探索了基于mRNA的疫苗(BNT162b2)和腺病毒疫苗(克威莎2019冠状病毒病疫苗)在整个转录组中的个体免疫反应。这些已发表的scRNA-seq数据集显示了不同疫苗诱导的不同个体免疫动态。随着临床实践的支持，传统灭活疫苗在传染病防控中发挥了重要作用。已研制出BBIBP-CorV和科兴疫苗两种SARS-CoV-2灭活疫苗，其中BBIBP-CorV在临床试验中对严重疾病的保护率高于科兴疫苗。最近一项针对科兴疫苗的scRNA-seq研究报道了潜在的可能性科兴疫苗相关副作用及全身炎症反应。然而，SARS-CoV-2疫苗诱导的免疫细胞的功能转录和TCR/BCR组库动态，以及宿主对灭活疫苗的适应性免疫应答的潜在细胞和分子机制尚不清楚。 图文解析：
图1 要点1： A.为了全面评估SARS-CoV-2灭活疫苗(BBIBP-CoV)接种后的免疫反应，根据纳入和排除标准。本次2019新型冠状病毒疫苗观察研究，共纳入9名健康供者(HDs)。首先，在接种(BV组,n=9)前采集9例HDs的外周血样本。随后，9名HD中有6名接受了2剂次的BBIBP-CorV疫苗。所有两剂疫苗接种参与者的外周血样本采集于首次接种(1V7组,n=6)后7天、第二次接种(2V7组,n=6)后7天和第二次接种(2V14组,n=6)后14天。使用基于微滴的单细胞测序方法(10×Genomics)整合5'基因表达的T和B细胞。此外，为了揭示疫苗接种和SARS-CoV-2感染之间的免疫反应差异，收集了17个已发表的PBMCs数据，对确诊的COVID-19患者进行了单细胞RNA和TCR/BCR测序。在这17个样本中，有6个样本来自COVID-19感染的中度症状患者，11个样本来自恢复期患者。将44份样本按照接种前(BV组,n=9)、第1剂(1V7组,n=6)接种后7天、第2剂(2V7组,n=6)接种后7天、第2剂(2V14组,n=6)接种后14天、有症状COVID-19患者(n=6)和恢复期患者(n=11)这6种临床情况进行分类。 B.从44个PBMC样本中获得263624个细胞。采用无监督的方法对筛选后的数据进行整合、降维和聚类。基于无监督聚类和每个簇的特征基因表达，确定了12种细胞类型。 C.这些细胞类型包括CD4+T细胞(CD3+CD4+)、CD8+T细胞(CD3+CD8+)、自然杀伤(naturalkiller，NK)、细胞低表达NCAM1(编码CD56)(CD56lowNK,NKG7+KLRF1+NCAM1low)，NK细胞高表达NCAM1(编码CD56highNK)(CD56lowNK,NKG7+KLRF1+NCAM1low)。NKG7+KLRF1+NCAM1high)、B细胞(CD79A+MS4A1+)、浆细胞(CD79A+JCHAIN+MZB1+)、CD14+单核细胞(CD14+S100A12基因+)，CD16+单核细胞(FCGR3A+MS4A7+)，单核细胞来源的树突状细胞(mDCs,FCER1A+CD1C+)，浆细胞样树突状细胞(pDCs,LILRA4+)，巨核细胞(PPBP+PF4+)和增殖细胞(MKI67+)。 D.为了揭示疫苗接种前后不同时间点细胞组成的动态变化，计算每个样本PBMCs中所有细胞类型的相对百分比。与BV组相比，1V7、2V7和2V14组CD14+单核细胞显著增加，这与使用流式细胞术进行的BBIBP-CorV疫苗接种研究结果一致。与BV组相比，1V7组CD16+单核细胞的相对百分比显著增加。CD14+单核细胞和CD16+单核细胞都具有产生细胞因子的巨大潜力，在体液免疫中发挥抗胞外病原体入侵的作用。与BV组相比，2V7和2V14组的增殖细胞比例显著增加。1V7组浆细胞相对丰度增加。相比之下，B细胞(排除浆细胞)的相对百分比在第2次给药后有所下降。与BV组相比，2V14组CD8+T细胞减少。 E.为了进一步验证疫苗的免疫效果，使用间接酶联免疫吸附试验试剂盒检测了2019新型冠状病毒SpikeRBDIgG水平和中和抗体。第2剂次接种后，抗S-RBDIgG水平和中和抗体显著升高。 F.计算表达细胞因子基因的细胞所占的比例Il1B、Il2、Il4、Il5、Il6、Il10、Tnf和Ifng，单细胞分辨率。与BV组相比，IL2的细胞比例在2V7和2V14组中显著增加。表达IL4的细胞所占比例在2V14组中显著增加。
图2 要点2： A-B.为了进一步研究BBIBPCorV免疫后天然免疫细胞的转录组变化，比较免疫前后单核细胞和NK细胞的基因表达谱。 C-F.聚焦于2V7和2V14组进行进一步分析。与BV组相比，在2V7和2V14组的CD14+单核细胞和CD16+单核细胞中鉴定了DEGs。功能富集分析显示，2V7和2V14组CD14+单核细胞中上调的DEGs富集在"白细胞介素-1产生"、"细胞因子产生的正调节"、"干扰素-γ的细胞反应"和"I型干扰素产生"通路。有趣的是，IL-1家族细胞因子是潜在的黏膜疫苗佐剂，可以诱导针对流感病毒等病原体的抗原特异性免疫反应。上调的DEGs在2V7和2V14组CD16+单核细胞富集于"I型干扰素产生"、"细胞因子产生的正调节"、"对干扰素γ的反应"、"Toll样受体信号通路"和"抗原加工和外源性抗原"通路。 G.分析了I型干扰素产生相关通路中免疫细胞的表达情况。发现在2V7和2V14组中，单核细胞、mDCs和NK细胞中I型干扰素的产生是一致的并且显著上调。
图3 要点3： A-C.为了表征T细胞亚群的变化，根据T细胞标志性基因的表达对PBMCs中的T细胞进行了亚聚类，得到了15个T细胞亚群。为了深入了解疫苗接种前后T细胞亚群的特征，计算每个T细胞亚群占每个样本总T细胞群的相对百分比。与BV组相比，1V7组CD4_Tem_ANAX1细胞比例显著增加。与BV组相比，1V7、2V7和2V14组CD4_Th_GATA3和CD4_Tcm_AQP3细胞扩增。CD4_Th_GATA3细胞具有高表达GATA3的Th2细胞特征，通过产生IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子参与针对胞外病原体的体液免疫。增加的中枢记忆性CD4+T细胞(CD4_Tcm_AQP3)产生与快速T细胞二次扩增相关的细胞因子，如IL-2。此外，与BV组相比，1V7组CD8_Effctor_GNLY细胞比例显著增加，并在第2剂接种后恢复至基础水平。 D-E.为了进一步研究转录组的变化，在加强免疫后的T细胞中，比较了2V7和2V14组与BV组在CD4+T和CD8+T细胞中的基因表达谱。对于CD4+T细胞，功能富集分析表明，2V7和2V14组上调的DEGs富集在"T细胞活化"、"白细胞-细胞粘附"、"T细胞分化"、"T细胞受体信号通路"和"B细胞活化"通路。在CD4+T细胞中，与BV组相比，IFN相关基因IFITM3和广谱抗逆转录病毒因子SAMHD1的表达在2V7和2V14组中显著上调。 F.结果表明加强免疫后机体的抗病毒免疫增强。此外，分析了记忆中T细胞受体信号通路和ThCD4+T细胞亚群在四个时间点的表达，发现T细胞受体信号通路的表达在这些细胞亚群中显著上调，包括记忆性CD4+T细胞，辅助性CD4+T细胞和调节性CD4+T细胞来自2V7和2V14组。 G.JAK-STAT信号通路和PI3K-Akt信号通路在2V14组CD4+T细胞中显著富集。
图4 要点4： A-B.为了深入了解BBIBPCorV疫苗免疫应答过程中TCR组库的动态变化，从测序数据中重建了全长TCR序列。评估了TCRα和TCRβ的互补决定区3(CDR3)长度分布TCRβ链跨越四个时间点。结果显示，在接种前后，CDR3长度的分布没有显著变化。 C-F.通过比较疫苗接种前后的组库分配来检查TCRα和TCRβ基因使用的偏倚。在TCRα链内，与免疫前相比，结果显示：1)1V7、2V7和2V14组TRAV39和TRAJ8表达量升高；2)TRAJ3的表达在1V7和2V7组增加，在2V14组恢复到基础水平；3)TRAV34、TRAJ15和TRAJ24的表达在2V7组增加，在2V14组恢复到基础水平；4)2V14组TRAV36/DV7表达增加。在TCRβ链内，与免疫前相比，结果显示：1)TRBV16的表达在1V7和2V7组升高，在2V14组恢复到基础水平；2)TRBV12-5的表达在1V7组增加，在2V7和2V14组恢复到基础水平；3)的表达式TRBV3-1在2V14组升高。 G.比较了接种前后配对的VJ频率。结果显示，2V14组TRAV41/TRAJ53、TRAV26-1/TRAJ41和TRAV8-4/TRAJ44的频率增加。
图5 要点5： A-B.克隆分析显示，在2V14组中，疫苗接种诱导了CD4+T细胞中小克隆(克隆大小:2~5个细胞)的扩增；然而，在CD8+T细胞中没有观察到明显的克隆扩增。接下来计算4个时间点T细胞亚群的TCR多样性。结果显示：1)与免疫前相比，2V7和2V14组CD4_Tcm_AQP3细胞TCR多样性降低；2)2V14组CD4_Th_GATA3、CD4_Treg_FOXP3和CD8_Naive_LEF1细胞TCR多样性降低；3)1V7和2V14组中CD4_Naive_CCR7细胞的TCR多样性降低。 C-D.DEG分析显示，Th和记忆性T细胞分化转录因子(TF)基因TCF7，LEF1，与BV组相比，STAT1、STAT5B和IKZF1在2V7和2V14组中表达上调。功能富集分析显示，2V7和2V14组上调的DEGs富集在"T细胞活化"、"T细胞分化"、"T细胞受体信号通路"和"B细胞活化"通路。 E.FOXO信号通路、JAK-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路、B细胞活化和体液反应相关通路在2V14组克隆性扩增的CD4+T细胞中显著富集。 F.使用SCENIC预测了核心转录因子，TF调节子LEF1(12g)、STAT1(940g)、STAT5B(174g)和IKZF1(334g)在2V14组中显著上调。 G.与Th1细胞分化相关的TF调节子STAT1(940g)的表达在接种(1V7、2V7和2V14组)后显著上调。而Th1相关的TF调节子STAT4(14g)和Th2相关的TF调节子STAT6的表达水平在2V7和2V14组显著上调。
图6 要点6： A-B.为了追踪不同B/浆细胞亚群的动态变化，根据B细胞标志基因的表达将B/浆细胞分为5个亚群。这5个B/浆细胞亚群包括幼稚B细胞(Naïve_B,CD79A+MS4A1+IGHD+)、中心B细胞(Germinal_central_B,CD79A+MS4A1+NEIL1+)、记忆B细胞(Memory_B,MS4A1+CD27+)、非典型记忆B细胞(Atypical_memory_B，MS4A1+CD27+CIB1+)和浆B细胞(Plasma_B_XBP1，CD79A+CD38+MZB1+)。 C.为了深入了解B/浆细胞亚群的特征，评估疫苗接种过程中各亚群的分布情况。与BV组相比，记忆B的比例(Memory_B)细胞在接种(1V7、2V7和2V14组)后增加。1V7和2V14组非典型记忆B(Atypical_memory_B)细胞比例增加。相比之下，先前的scRNA-seq研究表明，与健康供者相比，COVID-19患者记忆B细胞的比例降低。1V7组Plasma_B_XBP1细胞比例增加。相比之下，接种(1V7、2V7和2V14组)后，幼稚B细胞比例降低，这与最近一项涉及scRNA-seq分析的COVID-19mRNA疫苗接种研究结果一致。 D.为了进一步研究加强免疫后B/浆细胞的差异转录组变化，将2V7和2V14组B/浆细胞的表达谱与BV组进行了比较。 E.与BV组相比，功能富集分析显示，2V7和2V14组上调的DEGs富集在"B细胞活化"、"B细胞受体信号传导"和"Toll样受体信号通路"通路。 F.与分析了免疫球蛋白产生通路在B/浆细胞亚群中的表达情况。与BV组相比，2V7和2V14组的Naêve_B、Germinal_central_B、Memory_B和Atypical_memory_B细胞显示出更高的免疫球蛋白产生通路的富集。
图7 要点7： A-B.与BV组相比，2V14组中重18aa和轻链13aa的频率增加。 C-F.比较了接种后四个时间点VJ基因的使用情况。值得注意的是，与BV组相比，基因使用分析显示：1)IGHV2-26和IGHV3-73的表达在2V7和2V14组中增加；2)2V14组IGHV3-74表达增加。此外，IGHJ1和IGHJ4的表达在1V7和2V14组中增加。此外，与BV组相比，观察到：1)在接种(1V7、2V7和2V14组)后，IGKV3-15的表达增加；2)IGKV3-10和IGLV10-54在2V7和2V14组表达增加；3)IGKV1-8、IGLV6-57、IGLV8-61和IGLJ3的表达在2V14组增加。 G.为了进一步研究BCR的偏向性V-J重排，比较4个时间点(图7G和S7B)的配对VJ频率。结果表明：1)IGKV1-16/IGKV3的频率较高；IGKJ2、IGHV1-24/IGHJ4和IGLV10-54/IGLJ3在2V7和2V14组增加。 H.评估免疫球蛋白重链基因IgA、IgD、IgG和IgM在4个时间点B细胞中的分布。与BV组相比，1V7和2V14组IGHA和IGHG的丰度增加。接种(1V7、2V7和2V14组)后，IGHD和IGHM的丰度降低。
图8 要点8： A-B.单核细胞和mDCs(包括IL-6和TNF-α产生途径)中促炎细胞因子产生相关通路的表达在中等症状的患者中上调，而在接种后的个体中没有观察到明显的变化。 C.与接种疫苗前相比，T细胞细胞因子产生相关基因的表达在接种疫苗后和恢复期患者中上调，但在中度症状患者中未观察到明显变化。 D.与接种前相比，加强免疫后和中度症状患者的B细胞中免疫球蛋白产生途径的表达上调，并在恢复的恢复期患者中恢复至正常水平。 E-G.发现IGHV2-26的表达在接种疫苗的参与者和恢复的恢复期患者中比接种疫苗前的参与者增加。IGLV3-10和配对的IGHV4-30-2/IGHJ4的表达在疫苗接种参与者、中度症状患者和康复患者中上调。 本文小结： 综上所述，研究在单细胞水平上揭示SARS-CoV-2疫苗免疫应答的细胞和分子基础，特别是BBIBP-CorV诱导的CD4+T细胞依赖的抗体应答提供了新的见解。研究结果可能有助于开发更有效、持久和安全的SARS-CoV-2预防性疫苗。 参考文献： TongR,LuoL,ZhaoY,SunM,LiR,ZhongJ,ChenY,HuL,LiZ,ShiJ,LyuY,HuL,GuoX,LiuQ,ShuangT,ZhangC,YuanA,SunL,ZhangZ,QianK,ChenL,LinW,ChenAF,WangF,PuJ.CharacterizingthecellularandmolecularvariabilitiesofperipheralimmunecellsinhealthyrecipientsofBBIBP-CorVinactivatedSARS-CoV-2vaccinebysingle-cellRNAsequencing.EmergMicrobesInfect.2023Dec;12(1):e2187245. https://doi.org/10.1080/22221751.2023.2187245 |
