IF30.5 Nature Immunology│CXCR6协调大脑CD8+ T细胞驻留并限制小鼠阿尔茨海默病

前言：

2023年9月7日，美国圣裘德儿童医院迟洪波和苏伟（第一作者）研究团队在Nature Immunology上发表题为“CXCR6 orchestrates brain CD8⁺T cell residency and limits mouse Alzheimer’s disease pathology”的研究论文，发现共表达CXCR6和PD-1的大脑驻留CD8⁺T细胞，其存在于患有AD人和小鼠大脑的斑块相关小胶质细胞中。研究还发现CD8⁺T细胞阻碍AD进展，包括β淀粉样蛋白沉积和认知能力下降。

背景介绍：

炎症和异常免疫是阿尔茨海默病(AD)和其他神经退行性疾病的标志。小胶质细胞可以通过引发神经炎症，而适应性免疫细胞也会在AD患者中发生表型改变。然而，适应性免疫细胞在阿尔茨海默病发病过程中显示出有害和保护作用，这可能归因于适应性免疫系统的时间调节或功能异质性。此外，细胞间通讯正在成为感染和癌症中炎症和疾病结果的关键决定因素，但对脑实质中这种通讯的调节及其对神经炎症的贡献的理解尚缺乏。

图文解析：

图1

要点1：

a-b.对5xFAD13和非转基因(Non-Tg)对照小鼠的脑组织(以下称为脑)或脑膜硬脑膜和蛛网膜组织(以下称为脑膜)中的CD45^int/+CD11b⁺(主要是小胶质细胞)和CD45⁺CD11b ^-(非小胶质细胞免疫细胞)细胞进行了scRNA-seq分析。

c.均匀歧形近似和投影(UMAP)和聚类分析确定了12个不同的免疫细胞簇，与疾病相关的小胶质细胞(DAM)仅限于5xFAD小鼠，值得注意的是，在5xFAD小鼠中，CD8⁺ T细胞的频率升高，而CD4⁺ T细胞或γδ T细胞的频率没有升高，这种观察结果也延伸到APP/PS1。

d.流式细胞术分析显示，与Non-Tg小鼠相比，5xFAD小鼠大脑中CD3⁺TCRβ⁺ T细胞的频率和数量增加，这主要归因于CD8⁺ T细胞的积累。

e.CD3⁺或CD8⁺ T细胞，而不是CD4⁺ T细胞，在5xFAD小鼠中比在非tg小鼠中表现出更明显的年龄依赖性积累，这与5xFAD小鼠中Aβ斑块积累的开始一致。

f-i.免疫染色实验在5xFAD小鼠中验证了这些观察结果。此外，在APPNL-G-F小鼠的大脑中积累了CD3⁺或CD8⁺ T细胞。由于CD8⁺ T细胞在AD个体的大脑中增加，这些结果表明CD8⁺ T细胞积累在小鼠AD模型和AD个体中是一个保守特征。

图2

要点2：

a-d.小胶质细胞和CD8⁺T细胞之间趋化因子-趋化因子受体相互作用的数量比其他细胞类型之间更多，这表明小胶质细胞和CD8⁺ T细胞之间可能存在细胞间通讯。对单个趋化因子配体受体对的分析显示，CXCL16-CXCR6是5xFAD小鼠小胶质细胞和CD8⁺T细胞之间排名第一的配体对。因此，Cxcl16和Cxcr6分别在小胶质细胞和T细胞簇中高表达。研究发现CXCL16在5xFAD小鼠的小胶质细胞中表达适度增加。

e-f.在AD2患者中，小胶质细胞的激活或炎症状态与Aβ的进行性积累和认知能力下降相一致。与这些影响相关的是，晚期AD22患者死后脑组织中CXCL16的表达上调，这在三个独立蛋白质组学数据集的荟萃分析中也很明显。

g.对大量RNA-seq数据和单核RNA-seq数据的分析显示，CXCL16基因表达主要在小胶质细胞中上调。因此，AD相关的CXCL16表达改变在人类中发生，表明CXCL16在小鼠AD模型和人类之间的保守调节。

h.接下来，研究了CXCR6的组织特异性调控和功能重要性。脑组织中表达CXCR6的CD8⁺T细胞比例远高于脾脏，5xFAD小鼠脑组织中表达CXCR6⁺CD8⁺T细胞的频率和数量均增加(而非其他组织)。相比之下，没有观察到CXCR6⁺CD4⁺T细胞的积累。因此，CXCR6在5xFAD小鼠脑CD8⁺T细胞中的表达以组织特异性的方式上调。

图3

要点3：

a-c.基于scRNA-seq描述的免疫细胞类型之间的配体-受体相互作用推断了细胞串音，并揭示了小胶质细胞与CD8⁺ T细胞的推定相互作用。此外，基因集富集分析(GSEA)显示，5xFAD小鼠的小胶质细胞富集了趋化因子和趋化因子受体相关的特征。

d.此外，与稳态小胶质细胞相比，DAM中的Cxcl16表达升高，与DAM中趋化途径的富集一致。

e.此外，观察到DAM和CD8⁺ T细胞之间的CXCL16-CXCR6相互作用强于M0和CD8⁺ T细胞之间的CXCL16-CXCR6相互作用。这种细胞间通信轴在APP/PS1小鼠中也很明显，包括DAM和CD8⁺ T细胞之间的通信强于M0和CD8⁺ T细胞之间的通信。

f.接下来，在5xFAD; Cxcr6 ^-/-小鼠中检测AD相关病理。

g.通过免疫染色确定，雌性5xFAD; Cxcr6^-/-小鼠的Aβ沉积加剧，雌性小鼠的脑组织匀浆免疫印迹分析也观察到这种变化。

h.然而，雌性和雄性5xFAD; Cxcr6^-/-小鼠皮质中可溶性和不可溶性a-β1-40和a-β1-42浓度以及海马中可溶性a-β1-40浓度均升高。

i-j.此外，5xFAD; Cxcr6^-/-小鼠的两性认知记忆功能受损。

图4

要点4：

a.在5xFAD小鼠中，高度扩增的CD8⁺T细胞克隆，特别是克隆型大小>20的CD8⁺T细胞克隆占脑CD8⁺ T细胞总数的比例更大。

b-c.脑CD8⁺ T细胞的亚簇鉴定出8个亚簇，通过离散的基因特征来区分。许多这些亚簇包含扩展的克隆型，标记为高Pdcd1表达，特别是亚簇2。

d-e.此外，与非TG小鼠相比，在5xFAD小鼠的亚簇2中观察到大克隆型(克隆型大小>20)的频率增加。因此，注意到克隆扩增和Pdcd1⁺(相对于Pdcd1^-)细胞的转录组之间存在很强的正相关(r=0.82)。

f-g.此外，5xFAD小鼠的脑PD-1⁺CD8⁺T细胞显著增加，进一步支持脑内疾病相关克隆扩增。

h.此外，成像分析显示CD8和PD-1在5xFAD小鼠和AD个体的大脑中共表达。这些结果表明，PD-1上调发生在5xFAD小鼠大脑中的CD8⁺T细胞上，并且PD-1的表达在很大程度上区分了克隆扩增与非扩增的CD8⁺T细胞。

图5

要点5：

a-b.与非Tg小鼠相比，来自5xFAD或APPNL-G-F小鼠的脑CD8⁺(而非CD4⁺) T细胞14显示TRM细胞标志物CD69和CD103的表达增加，表明疾病条件下脑CD8⁺T细胞中的TRM细胞表型增强。与这一观点一致的是，免疫染色显示大多数脑CD8⁺T细胞不在脉管系统内。

c.此外，在静脉注射植物红蛋白(PE)偶联抗CD45以评估脑CD8⁺T细胞是来自循环(PE⁺)还是驻留在脑(PE^-)后，发现大多数脑CD8⁺ T细胞是PE^-细胞，其标志是PD-1相对于PE⁺细胞的表达升高。

c-d.此外，与非Tg小鼠相比，5xFAD小鼠大脑中PE-CD8⁺T细胞增加。因此，在5xFAD小鼠体内积累的PD-1⁺CD8⁺T细胞常驻在大脑中。支持不同AD小鼠模型的保守效应。

e.验证了这些分子在脑CD8⁺T细胞上的共表达，与非Tg小鼠相比，5xFAD小鼠中CXCR6⁺PD-1⁺CD8⁺ T细胞的频率和数量增加。

f.接下来，应用scTCR-seq分析来确定CXCR6是否协调5xFAD小鼠脑CD8⁺T细胞的克隆扩增，并发现CXCR6缺失后克隆扩增的CD8⁺T细胞显著减少。

g.Cxcr6缺失也降低了总CD8⁺T细胞中表达Pdcd1 的亚簇的比例。

h-i.此外，克隆扩增的CD8⁺T细胞与Pdcd1表达很大程度上重叠，在缺乏CXCR6的情况下，显示出大水平和中等水平扩增的克隆型显著减少。

k.更重要的是，5xFAD;Cxcr6^-/-小鼠的核心TRM细胞特征总体下调，克隆扩增或Pdcd1⁺CD8⁺T细胞。此外，5xFAD;Cxcr6^-/-和APPNL-G-F; Cxcr6^-/-小鼠CD8⁺T细胞中CD69⁺、CD103⁺和CD69⁺CD103⁺亚群的比例降低。这些结果共同表明，在小鼠AD背景下，CXCR6对脑CD8⁺T细胞中的TRM细胞至关重要，并揭示了CXCR6在脑CD8⁺T细胞克隆扩增和组织驻留程序之间的关键作用。

图6

要点6：

a-c.高分辨率共聚焦成像显示5xFAD小鼠中CD8⁺T细胞或CD3⁺T细胞与Iba1⁺小胶质细胞在Aβ斑块附近共定位。在AD患者的大脑中也观察到CD8⁺T细胞与Aβ和IBA1⁺小胶质细胞的密切关系。

d-e.考虑到这种空间接近性，通过分析5xFAD;B2m^-/-和5xFAD;Cxcr6 ^-/-小鼠的小胶质细胞，测试了CD8⁺T细胞积累对体内小胶质细胞炎症状态的贡献。5xFAD; B2m^-/-和5xFAD;Cxcr6^-/-小鼠的小胶质细胞显示TNF-α和pro-IL-1β表达增加或趋势增加，表明这些小鼠的小胶质细胞炎症状态增加。

f-g.此外，对5xFAD、Tcra^+/+和5xFAD、Tcra^-/-和5xFAD、B2m^+/+和5xFAD、B2m^-/-小鼠的小胶质细胞进行了scRNA-seq分析。

h.尽管M0和DAM的比例基本正常(由DAM特征基因鉴定)，发现5xFAD;Tcra^-/-和5xFAD; B2m^-/-小鼠的两个小胶质细胞亚群中干扰素特征富集。

i-j.此外，TNF-α信号信号在5xFAD;Tcra^-/-小鼠的两个小胶质细胞亚群和5xFAD;B2m^-/-小鼠的M0小胶质细胞中都富集。

图7

要点7：

a-c.这在患病的CNS36中存在具有免疫抑制功能的调节性CD8⁺T细胞，发现克隆扩增和Pdcd1⁺CD8⁺T细胞显示出这种调节性CD8⁺T细胞特征的富集，与抑制相关分子CD73、LAG3、CD39和TIGIT以及CXCR6的表达增加有关。为了直接测试CD8⁺T细胞是否对小胶质细胞有抑制作用，采用体外实验从脾脏CD44^hiCD8⁺T细胞生成PD-1⁺CD8⁺T细胞，并与原代小胶质细胞共培养。PD-1⁺CD44^hiCD8⁺T细胞的存在降低了受刺激小胶质细胞中TNF-α和IL-1β的表达。

d.5xFAD小鼠脑源性CD8⁺T细胞也抑制小胶质细胞产生促炎细胞因子。

e-f.此外，在雌性和雄性5xFAD B2m^-/-小鼠以及雌性5xFAD Cxcr6^-/-小鼠中观察到Iba1⁺小胶质细胞的积累和斑块相关小胶质细胞的增加。

本文小结：

综上所述，研究强调在Aβ斑块负担增加的情况下，组织内CD8⁺ T细胞的积累可以保持小胶质细胞功能的稳态。研究表明，虽然Aβ斑块负担可能引发促炎性小胶质细胞增生，但CD8⁺ T细胞在后期积累，并在减轻小胶质细胞炎症状态中发挥稳态作用，以限制进一步的Aβ斑块形成和认知能力下降。CXCL16-CXCR6介导的小胶质细胞与CD8⁺ T细胞的双向相互作用以及脑内CD8⁺ T细胞的免疫调节作用可能是神经退行性疾病的重要免疫治疗靶点。

参考文献：

Su, W., Saravia, J., Risch, I. et al. CXCR6 orchestrates brain CD8⁺ T cell residency and limits mouse Alzheimer’s disease pathology. Nat Immunol (2023).

https://doi.org/10.1038/s41590-023-01604-z