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IF16.6 Nature Communications│内皮Sp1/Sp3在卡托普利对雄性小鼠血压的影响中至关重要

前言:


2023921日,心血管重塑与功能研究重点实验室,国家卫生健康委员会和中国医学科学院和山东大学齐鲁医院心内科等多个实验室联合在Nature Communications发表题为Endothelial Sp1/Sp3 are essential to the effect of captopril on blood pressure in male mice”研究论文研究发现,SP1/SP3的基因沉默或抑制导致严重的内皮功能障碍和高血压,以及SP1/SP3的过度表达改善了ANII诱导的内皮衰老和凋亡,提示SP1/SP3可能是治疗心血管疾病药物设计的潜在靶点研究确定USP7是一种能转移到与SP1/SP3结合的细胞核中的乙酰激活脱泛素酶。在本研究证明了在诱导的SP1/SP3的血管调节和抗高血压作用中,hdac1Ubi等量化调节的乙酰化发挥了重要作用。已知Usp7hdac1在调节大量基因和蛋白质的活性或丰富性方面发挥着重要作用。研究仅限于hdac1介导的脱乙酰化对与USP7结合的SP1/SP3的影响,但是hdac1USP7之间的关系还需要进一步的研究。


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背景介绍:

高血压是心血管疾病的主要危险因素,是全世界发病和死亡的最主要原因。尽管最近广泛的研究讨论了高血压的多因素性质,但进一步探索其发病机制和寻找新的治疗靶点是很重要的。在众多高血压病因中,内皮功能障碍是常见的原因,被认为是微血管和大血管并发症发展的前兆。内皮是血流和外血管壁之间的选择性渗透屏障,也是调节血管张力和血压的重要平衡器官。氨活化蛋白激酶(AMPK)在各种生理病理过程中起着重要作用。AMPK降低调节了荧光素-1的表达,并提高了内皮一氧化氮合酶(ENOS)的活性。然而,对AMPK表达的调控机制仍有待探讨。Sp1和Sp3是specificity protein/Krüppel-like factor (Sp/KLF)转录因子家族的成员,由3个锌指蛋白组成,识别富含G的启动子元件(GC-box和相关的GT-box)。Sp1和Sp3在哺乳动物细胞中广泛表达。Sp1基因敲除的小鼠在胚胎第10.5天以后不能存活,并且表现出广泛的异常。Sp3基因敲除小鼠生长迟缓,在产前或出生时因心脏畸形等并发症而死亡。在体内,Sp基因的缺失揭示了Sp1和Sp3截然不同的功能;然而,它们在造血系统的早期发育阶段也表现出重叠的功能。内皮细胞Sp1/Sp3调节视网膜、病理和肿瘤模型中的血管生成。考虑到Sp1/Sp3在心血管发育和血管生成中的重要作用因此,在内皮细胞和相关血管疾病中的作用需要进一步研究。研究发现,在雄性小鼠中,内皮SP1和SP3的目标缺失导致血清亚硝酸盐/硝酸盐水平下降,内皮依赖性血管扩张紊乱,以及高血压和心脏重塑的发生。此外,卡托普利的有利作用被SP1/SP3的内皮缺失所抵消。


图文解析:


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图1


要点1:

A-F.为了确定Sp1Sp3是否参与内皮功能障碍和高血压的发病机制,检测了它们在高血压患者肠系膜动脉和高血压小鼠动脉内皮中的表达。免疫荧光染色显示,当Sp1/Sp3DAPI共定位时,Sp1Sp3主要表达于内皮细胞核。在高血压患者的肠系膜动脉内皮中,Sp1Sp3较健康个体显著下调。在AngⅡ诱导的高血压小鼠的主动脉内皮细胞中,Sp1Sp3的水平也降低

G-I.在培养的人脐静脉内皮细胞中,AngⅡ、ET-1H2O2均可显著降低Sp1Sp3的表达。

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图2


要点2:


A-C.为了阐明Sp1Sp3在体内血管内皮细胞中的生物学意义,将Sp1fl/fl/Sp3fl/fl小鼠与VECADCreERT2小鼠杂交产生VE-CAD-CreERT2+/Sp1fl/fl/Sp3fl/fl小鼠,连续5d腹腔注射他莫昔芬产生Sp1/Sp3ECKO小鼠(dKO小鼠)。同窝VECAD-CreERT2-/Sp1fl/fl/Sp3fl/fl小鼠用相同剂量的他莫昔芬处理作为对照(CTR小鼠)。检测了Sp1/Sp3在血管内皮细胞中的敲除效率。免疫荧光检测发现,与CTR小鼠相比,dKO小鼠主动脉内皮中Sp1/Sp3含量显著降低,证实了Sp1/Sp3dKO小鼠中的有效缺失。

D.为了表征dKO小鼠的表型,测量了血压:dKO小鼠在7~12周龄时表现出明显的收缩压(SBP)和平均血压(MBP)升高。E.通过乙酰胆碱(Ach)诱导的肠系膜动脉舒张来评估内皮功能。在10-4~10-10 mol/L浓度范围内,dKO小鼠肠系膜动脉对Ach的舒张反应显著低于CTR小鼠。

F.用非选择性NO合成酶抑制剂L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME10-4 mol/L)预处理肠系膜动脉30分钟,Ach在小鼠之间引起相似的反应。

G.肠系膜动脉对内皮非依赖性药物硝普钠(SNP,10-4~10-10 mol/L)引起的舒张无差异。

H.CTR小鼠相比,dKO小鼠血清亚硝酸盐/硝酸盐水平降低约40%

I.为了确定NO水平较低的原因,检测了CTRdKO小鼠原代MLECseNOS的活性。Sp1Sp3缺失显著减弱了MLECs中增加的eNOS活性。

J.与高血压表型一致,发现dKO小鼠的心脏明显大于CTR小鼠。

K-O.使用超声心动图测量心脏功能,dKO小鼠表现出肥大表型,表现为舒张期左心室后壁和收缩期左心室后壁厚度增加,射血分数和短轴缩短率。

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图3


要点3:


A-C.HUVECs中用siRNA敲低Sp1和Sp3后,AMPKα1、AMPKα2和p-AMPKα(Thr172)蛋白水平和AMPKα1/AMPKα2mRNA水平下调,但膜内陷素-1蛋白水平上调。相反,在HUVECs中瞬时过表达Sp1和Sp3显著降低膜内陷素-1水平,增加AMPKα1、AMPKα2和p-AMPKα(Thr172)蛋白水平

D.HUVECs中过表达Sp1/Sp3上调AMPKα1和AMPKα2的mRNA水平。

E.IF染色进一步证实dKO小鼠主动脉内皮中AMPKα的蛋白水平显著降低。

F.免疫组织化学(IHC)染色显示,dKO小鼠主动脉内皮细胞层膜内陷素-1蛋白表达水平显著升高。G-I.ChIP与抗Sp1或Sp3的抗体交联在结合位点簇上,因此Sp1和Sp3均可与反转录的AMPKα1(-68/-58bp)和AMPKα2(-133/-123bp)启动子结合。

J.为了进一步了解Sp1和Sp3对AMPKα1和AMPKα2的转录调控,克隆了荧光素酶基因上游AMPKα1和AMPKα2的不同截短启动子,以产生截短启动子报告子。观察到的AMPKα1启动子活性在-85~-49区段与pGL-3相比分离出一个最小的Ad-Sp1和Ad-Sp3反应元件,这表明该核心区域在调节AMPKα1转录中的作用。

K.为了验证Sp1和Sp3在AMPKα2启动子中的调控作用,在Ad-Sp1或Ad-Sp3处理后,除-206至-122区域外,缺失体显示启动子活性显著增加,这表明Sp1和Sp3与该区域存在特异性结合。

L-M.为了验证AMPKα1启动子中Sp1和Sp3的转录因子结合位点,对这一单独的位点进行了替换突变,与野生型启动子相比,导致转录活性显著降低。此外,与转染野生型启动子的细胞相比,转染突变片段的HEK293T细胞显示出更低的荧光素酶活性。

N-O.HUVECs中,通过siRNA敲低Sp1或Sp3证实野生型AMPKα1和AMPKα2的荧光素酶活性显著降低,而突变启动子构建物则无此作用。

P-Q.此外,使用Sp1转录激活的特异性抑制剂(它通过阻断Sp1和Sp3与GC富集区的结合而发挥作用)进一步证实Sp1对AMPKα1和AMPKα2转录的影响。ChIP实验发现MITA可以抑制Sp1与AMPKα1和AMPKα2启动子的结合。

R.MITA处理的HUVECs中,转染野生型AMPKα1或AMPKα2的荧光素酶活性也降低,但突变启动子的荧光素酶活性没有降低。

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图4


要点4:


A.为了进一步探索Sp1和Sp3调节内皮功能的分子机制,使用与内皮功能障碍发病机制相关的AngII作为代表性刺激物。抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的活性降低了AngⅡ诱导的Sp1和Sp3的蛋白水平,这表明AngⅡ通过促进活性氧(ROS)和减少Sp1和Sp3的表达来加重内皮功能障碍

B.过表达Sp1或Sp3显著改善AngⅡ诱导的内皮细胞衰老,表现为内皮细胞衰老标志物P16和P21的表达降低。

C.HUVECs中通过siRNA敲低AMPKα,降低了Sp1和Sp3诱导的p-ULK1(Ser555)和微管相关蛋白1轻链3(LC3)II/I比值的水平,并增加了p62的表达。因此,AMPKα在Sp1/Sp3诱导的自噬中起着至关重要的作用。

D-E.此外,通过流式细胞术和western blot检测发现,与CTR小鼠相比,AngⅡ诱导Sp1/Sp3缺失的MLECs发生更严重的凋亡。

F.为了进一步确认抑制Sp1和Sp3是否会引起内皮功能障碍,C57BL/6J小鼠被长期使用抗癌剂MITA处理3周。与野生型小鼠相比,MITA处理的小鼠SBP和MBP更高。

G-K.给予MITA后,由于eNOS活性降低,内皮依赖性血管舒张功能受损,血清亚硝酸盐/硝酸盐水平降低,这表明MITA在体内加重了内皮功能障碍。

N.IF染色显示,MITA处理的主动脉内皮中AMPKα含量显著降低。

L-O.此外,WB显示MITA介导的AMPKα1、AMPKα2和p-AMPKα(Thr172)蛋白水平的降低导致MITA处理的小鼠MLECs中膜内陷素-1表达增加;IHC染色也证实了这一点。M.QPCR检测发现,注射MITA降低了AMPKα1和AMPKα2的mRNA水平,这表明MITA通过抑制Sp1/Sp3的活性来抑制AMPKα1/AMPKα2的转录。

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图5


要点5:


A.CTR和dKO小鼠的SBP和MBP在7天后下降,但Ad-LacZ的给药对血压没有影响。

B.给予CA-AMPK后,Ach诱导的两种、CTR和dKO小鼠内皮舒张反应均得到改善。

C-D.CA-AMPK不能改善L-NAME阻断的内皮依赖性舒张,对SNP引起的内皮非依赖性舒张无影响。

E-F.此外,在Sp1/Sp3缺陷的MLECs中,CA-AMPK处理显著增加了血清亚硝酸盐/硝酸盐水平和eNOS活性。G.此外,CA-AMPK降低了CTR和dKO小鼠MLECs中eNOS与膜内陷素-1的结合。H.通过CD31免疫荧光染色证实了C-AMPK增加了CTR和dKO小鼠内皮细胞中p-AMPKα(Thr172)的水平。

I.与此一致的是,CA-AMPK治疗后主动脉内皮膜内陷素-1表达降低

J-K.CA-AMPK给药可消除AngⅡ诱导的MLEC凋亡,表明Sp1和Sp3调控的AMPKα在AngⅡ诱导的内皮细胞凋亡中发挥重要作用。

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图6


要点6:


A-D.为了确定ACEI是否通过Sp1/Sp3改善内皮功能障碍和降低血压,CTR和dKO小鼠腹腔注射卡托普利。卡托普利降低血压并改善CTR肠系膜阻力动脉的内皮依赖性舒张,但对dKO小鼠无影响。

E-F.卡托普利通过增强CTR小鼠eNOS活性增加血清硝酸盐/亚硝酸盐水平,但对dKO小鼠无影响

G.与此相一致的是,在卡托普利处理的CTR小鼠MLECs中,eNOS与膜内陷素-1的结合减少,而dKO小鼠则没有。

H.IF染色证实卡托普利处理的CTR小鼠主动脉中AMPKα水平增加,而卡托普利处理后的dKO小鼠没有变化。

I.此外,IHC分析显示,与dKO小鼠相比,CTR小鼠主动脉中由卡托普利治疗调节的膜内陷素-1蛋白水平降低。

J-K.此外,卡托普利降低了AngⅡ诱导的CTR MLECs凋亡,但对AngⅡ处理的Sp1/Sp3缺陷的MLECs没有影响。

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图7


要点7:


A.卡托普利使Sp1Sp3蛋白水平增加,用B1阻断剂处理后Sp1Sp3蛋白水平降低,但B2阻断剂处理后Sp1Sp3蛋白水平无明显变化。

B.卡托普利不改变Sp1Sp3mRNA水平。

C-D.ChIP实验表明,卡托普利增加了Sp1Sp3AMPKα1AMPKα2启动子的结合,这种作用被B1阻断剂所抑制。

E-F.为了进一步验证卡托普利的作用,在卡托普利存在的情况下,AMPKα1AMPKα2荧光素酶结构被显著激活,但这种作用被Sp1/Sp3结合位点的突变或B1阻断剂处理所消除H-G.这些结果表明B1受体是卡托普利通过Sp1Sp3诱导AMPKα1/AMPKα2转录的主要受体。此外,确定了在体外病理条件下,卡托普利是否可以增加Sp1Sp3的水平。卡托普利处理逆转了AngⅡET-1H2O2引起的Sp1Sp3水平降低,但对Sp1Sp3mRNA水平没有影响。

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图8


要点8:


A-D. Sp1/Sp3Ang/ET-1/H2O2显著多聚泛素化。与Flag-Sp1-WT相比,突变的Flag-Sp1-K703A蛋白具有较低的基础泛素化水平,对卡托普利或Ang/ET-1/ET-1无反应。相反,卡托普利可以降低Sp1/Sp3的多聚泛素化。此外,在转染携带Flag-Sp3-WTFlag-Sp3-K551R的质粒的HUVECs中观察到类似的结果,其中Lys-551残基突变为精氨酸。

E.卡托普利处理后HUVECsSp1/Sp3乙酰化水平明显降低。

F.与非卡托普利条件相比,卡托普利条件下Sp1Sp3可结合更多的HDAC1蛋白,提示卡托普利诱导HDAC1募集Sp1/Sp3,导致Sp1/Sp3乙酰化水平降低。

G-H.此外,卡托普利诱导了更多的Sp1/Sp3AMPKα1AMPKα2启动子的结合,而HDAC1抑制剂TSASAHA抑制了这种结合

I.荧光素酶活性检测结果与Ch IP结果相似。




本文小结:


综上所述,研究证明内皮特异性SP1/SP3缺失导致内皮功能障碍和高血压,ACE抑制剂和传统的抗高血压药物卡托普利通过调节内皮细胞中的SP1/SP3水平发挥了部分药理作用。研究人员将SP1/SP3作为Ampkα1Ampkα2的转录因子。研究结果丰富了对Ampkα表达调控机制的理解。SP1/SP3的基因沉默或抑制导致严重的内皮功能障碍和高血压,以及SP1/SP3的过度表达改善了ANII诱导的内皮衰老和凋亡,提示SP1/SP3可能是治疗心血管疾病药物设计的潜在靶点。




参考文献:

Lu, H., Jiang, X., He, L. et al. Endothelial Sp1/Sp3 are essential to the effect of captopril on blood pressure in male mice. Nat Commun 14, 5891 (2023).

https://doi.org/10.1038/s41467-023-41567-1




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