IF13.6 Science Advances | 给药剂量决定外泌体在受体细胞中的功效前言： 2023年9月1日来自于瑞典卡罗林斯卡学院的Samir EL Andaloussi课题组在Science Advances在线发表了题为“The cellular response to extracellular vesicles is dependent on their cell source and dose” 的研究性论文。该研究选取12种不同细胞来源外泌体和五个外泌体给药剂量，发现受体细胞对外泌体的反馈更加依赖于外泌体给药剂量，而不是细胞来源。
背景介绍： 大量研究证实，EVs是细胞通讯的重要媒介，不同细胞来源的EVs携带的生物信息分子（如蛋白质、核酸等）存在较大差异，这种差异赋予了EVs不同的生物学特性，如靶向到特定细胞、激活特定信号通路等。为了解EVs来源细胞和剂量对其引发的受体细胞应答存在哪些影响，研究人员分离纯化获得来自12种不同细胞的EVs，以不同的剂量（20,2000,200 000particles/cell）处理人成纤维细胞，通过单细胞RNA测序分析人成纤维细胞对不同处理的反应。 图文解析：
图1 要点1： A.为了判断来自不同细胞来源的EVs的共同和特异性细胞反应，设计了一种实验装置，其中人成纤维细胞未经处理，用储存缓冲液孵育，或用EVs处理24小时，然后通过RNA测序进行分析。虽然EVs在免疫细胞过程中的作用已经得到了很好的证实，但之所以使用成纤维细胞，是因为它们代表了一种常见的原代人类细胞类型，可以接受EVs的治疗。分析了来自12个细胞来源的EVs，这些细胞被分成5组相似的细胞类型:BJ-5ta成纤维细胞、骨髓、脐带血和Wharton’s jelly来源的间充质干细胞(MSCs)被分类为MSC/成纤维细胞。将人脐带内皮细胞(HUVEC)和Panc-1细胞系归为上皮细胞。人胚胎肾(HEK) 293T贴壁细胞和HEK293自由式悬浮细胞在不同的生长条件下是相同的细胞类型。人羊膜上皮(HAEC)和CEVEC’s的羊膜细胞生成(CAP)羊水细胞被认为是子宫内起源的。最后，THP1单核细胞和Jurkat“T细胞”系被标记为起源于免疫细胞。 B.为了确认EVs的存在，对EVs相关蛋白CD9、CD63和CD81进行了流式细胞术分析，同时使用纳米颗粒跟踪来确定它们的浓度。然后5000个成纤维细胞，每个细胞分别用20、2000或200,000个颗粒(每孔共105、107或109个颗粒)处理。 C.为了评估这些治疗的效果，在光镜下对细胞进行成像，并通过流式细胞术分析细胞活力。结果显示，所使用的任何EVs都没有明显改变形态及毒性作用。由于EVs可能调节无数不同的途径，采取了一种公正和全面的方法来评估它们对应答细胞转录组的影响。 D.因此，使用数据集中最易表达基因tSNN -NN策略将所有样本映射在一起。虽然结果图将样品聚集在一起，但可以识别区域，使所有未经处理和存储缓冲处理的样品紧密聚集在一起。
图2 要点2： 为了量化这种分组是否基于处理的EVs细胞的剂量或细胞来源使用Infomap聚类将样本分成4个不同的簇。未处理的样品在聚类1中高度富集，因此这些样品在未来的比较中一起用作对照。在评估细胞源分组时，根据该参数未观察到特定簇中样品的明显富集。相反，不同剂量EVs处理的细胞有明显的梯度，这些细胞在特定簇中富集。因此，20个EVs处理的细胞主要集中在第2组，2000个EVs处理的细胞集中在第3组，每个细胞20万个EVs孵育的样本主要集中在第4组。为了确定是哪些基因分离了高剂量和低剂量EVs处理的成纤维细胞，在对照组和使用相同剂量EVs处理的所有样本之间进行了差异表达分析，而不管其细胞来源如何。为了了解差异表达基因的功能，对这些差异表达基因进行了基因本体分析。 E.结果显示，细胞经过20万个EVs显著增加了参与自噬、应激反应和跨膜运输的基因的表达。相反，高剂量的EVs抑制了参与胞外分泌、细胞外基质组织和分化的基因。 F.为了证实在EVs处理的细胞中观察到的转录组变化具有功能后果，使用了表达CD63-ThermoLuc的已建立的HEK293T细胞系，这使得从这些细胞中分泌的EVs能够被量化 G.根据转录组学数据，增加了越来越多的未标记的外源EVs在细胞培养基中添加，导致细胞分泌的工程化EVs数量呈剂量依赖性减少。
图3 要点3： A.为了评估细胞对来自不同细胞源的EVs的反应，在对照细胞和用不同剂量的EVs处理的细胞之间进行了单独的差异表达分析。出乎意料的是，当对照细胞与20个EVs处理的细胞相比时，显示出最多的差异表达基因，而20万个EVs处理的细胞中差异表达基因最少，以及每个细胞暴露于200,000 EVs的细胞中差异表达最少的基因。为了确保这不是由于不同数据集的结构差异造成的，检查了差异表达基因的变异、折叠变化和表达水平，但发现不同处理剂量下这些参数之间没有统计学差异。为了了解观察到的基因失调是否代表了对EVs的普遍细胞反应，在每个EVs剂量下评估不同细胞源差异表达的基因之间的重叠。 B.这表明，无论EVs细胞来源如何，每个细胞20万个EVs处理后的失调基因非常相似，而每个细胞20个EVs处理后的失调基因对每个细胞来源都是特异性的。当比较不同剂量时，这一趋势仍然存在，例如，每个细胞20万个EVs处理导致的基因失调与每个细胞2000个EVs处理导致的基因失调更相似，而不是每个细胞20个EVs处理导致的基因失调。这种模式进一步解释了图1D中观察到的样本分布;因此，全局分析忽略了基因失调个人样本。这一结果表明，低剂量EVs治疗会产生深刻的EVs细胞源特异性转录变化，而暴露于高剂量EVs会产生标准化的细胞反应。为了了解来自多个细胞源的EVs通常影响的生物学过程，基因本体论分析被用于描述至少五种EVs在单剂量下上调或下调的基因。这表明，每细胞20个EVs处理下下调的基因参与顺行囊泡靶向，而上调的基因参与基因表达。 C.相比之下，每个细胞20万个EVs处理通常下调的基因参与内吞作用，而上调的基因则参与溶酶体水解酶活性。为了从功能上证实高剂量EVs上调溶酶体活性，使用高分辨率随机光学重建显微镜(STORM)通过溶酶体相关膜蛋白1 (LAMP1)染色来观察溶酶体动力学。 D-E.因此，将成纤维细胞暴露于HEK293 freestyle或CAP EVs中的CD63-mNeonGreen (mNG)EVs中，结果显示，在高剂量EVs处理的细胞中，溶酶体显得更大。此外，这些扩增的溶酶体与丰富的CD63mNG EV相关。最后，使用机器辅助工作流程量化溶酶体面积证实，当细胞暴露于每个细胞200,000 EVs时，溶酶体明显大于每个细胞20 EVs的剂量。
图4 要点4： A-B.转录组学数据在体外的功能性证实使研究人员质疑高剂量EVs是否能在体内观察到相同的反应。为了判断这一点，给小鼠注射了表达CD63mNG的HEK freestyle EVs，在注射后3小时解剖小鼠的肝脏，对192个mNG+细胞进行分选，进行单细胞RNA测序。在定位到小鼠基因组和质量控制细胞过滤之后，根据数据集中最可变的基因制作了剩余细胞的tSNE-NN图。 C.该图没有显示明显的分组，并标记了肝脏中最丰富的细胞类型的共同标记(肝细胞:ASGR1和A1BG;Kupffer细胞:CD14和VSIG4;内皮细胞:EDNRB和OSMR)提示细胞为肝细胞。 D.为了根据暴露于EVs的剂量分离这些细胞，将每个细胞的reads映射到人类基因组，并评估每个细胞中人类与小鼠reads的比例。由于HEK细胞是人类细胞系，将单个细胞分为四组，描述它们的EV剂量(低、中低、中高和高)。 E-G.通过将这些组的分布与无偏聚类进行比较，观察到低剂量和高剂量EVs细胞在不同的簇中富集。 H.低剂量EVs和高剂量EVs细胞之间的差异表达分析显示，高剂量EVs细胞富集了参与溶酶体酸化、组装和定位的基因。相比之下，低剂量的EV细胞表达了与EV生物发生、内吞作用和体内平衡相关的基因。
图5 要点5： A.接下来,试图直接评估细胞对来自不同细胞来源的EVs的反应差异。由于在最低剂量下观察到对EVs最强大和独特的转录反应，因此将对照成纤维细胞转录组与来自不同细胞来源的每个细胞暴露于20 EVs的转录组一起绘制。 B.对分布不同类型EVs处理样本的簇进行量化表明，与对照细胞相比，免疫和HEK衍生EVs产生的转录变化最少，而子宫和MSC衍生EVs产生的转录变化最大。 C.为了研究来自特定细胞类型的EVs调节的基因，分析了至少两个剂量实验中每种EVs类型显著上调或下调的基因。一般来说，MSC-和上皮细胞来源的EVs调节的基因彼此相对相似，而HEK-、子宫内和免疫细胞来源的EVs引起不同的细胞反应。当比较来自同一组细胞的EVs的作用时，只有上皮细胞来源的EVs调节高度重叠的基因集。一种可能性是，不同类型的EVs诱导的反应反映了其源细胞的细胞或生态位活动。 D.为了验证这一假设，对每种EVs类型所调节的基因进行了基因本体分析。伤口愈合通常与MSC衍生的EVs相关，该分析显示，来自所有MSC的EVs以及HAEC和THP1，系诱导基因参与了这一过程。同样，同型细胞粘附是上皮细胞的一个重要特性，来自这两种细胞类型的EVs，以及来自Wharton’s jelly connective粘膜和CAP细胞的EVs，都促进了这些基因的表达。相比之下，只有HEK细胞衍生的EVs上调了参与氨基酸激活的基因，子宫细胞衍生的EVs诱导了促进DNA合成的基因，免疫细胞衍生的EVs引发了涉及免疫系统过程的细胞反应。为了判断这些转录效应是否转化为功能性细胞活性，研究人员评估了不同细胞类型的EVs对HUVEC细胞血管生成能力和增殖的影响，分别作为伤口愈合和DNA合成的量化指标。因此，首先证实，这些表型分别在MSCs和子宫细胞来源的EVs处理细胞的基因本体论分析中得到了强有力的反映。 E-F.然后，将脐带血MSC-、HEK293T-、CAP-和THP1细胞来源的EVs应用于HUVEC内皮细胞的管形成实验中。这些结果表明，只有脐血MSC EVs能够显著刺激内皮细胞分支，这与转录数据一致。 G.接下来，评估了处理过的细胞的增殖，发现CAP- (HEK-在较小程度上)和MSC细胞衍生的EVs能够激活细胞周期。这些结果证实，在测序数据中检测到的EVs特异性转录模式在功能性细胞活动中得到了证实。
图6 要点6： 为了进一步分解细胞对单个EVs类型的反应，首先将受控成纤维细胞与分别暴露于不同剂量EVs类型的成纤维细胞进行映射。这表明，每细胞剂量20EV与对照细胞的分离频率与剂量200,000EV一样最高，而且这两种剂量通常在对照细胞的干预下相互聚为了表征对单个EV类型有反应的基因，比较了来自同一细胞源组的EV失调的基因。在MSC/成纤维细胞组中，观察到的转录变化在脐带血MSC-和BJ-5ta衍生的EVs中最为相似。对不同类型间充质干细胞衍生的EVs的细胞反应与其起源组织(如骨)相适应骨髓间质干细胞衍生的EVs调节免疫过程，Wharton’s jelly间质干细胞衍生的EVs上调DNA复制。同样，上皮细胞的EV都上调了有氧呼吸基因，下调了与上皮迁移相关的基因。出乎意料的是，贴壁细胞和悬浮细胞的EVs产生了相对独特的反应，悬浮细胞的EVs刺激增殖，贴壁细胞的EVs激活代谢基因。由两种子宫源性EVs调节的基因都参与细胞周期活性。从支持胎儿生长的其他细胞衍生的EVs中也观察到这一特性。最后，免疫细胞EVs也产生了反映它们来源于的细胞类型的反应。例如，THP-1单核细胞EVs诱导了白细胞介素-8(IL-8)的产生，而Jurkat T细胞EVs上调了参与T细胞增殖的基因，并且都刺激了对细胞因子IL-3的反应，IL-3由髓系和淋巴系细胞分泌。由于EVs研究的最大兴趣之一是使用它们来提供治疗，一个重要的问题是来自某些细胞来源的EVs是否比其他细胞更容易被靶细胞吸收。 A.为了评估这一点，首先直接对不同的EVs样本进行RNA测序，以捕获每个样本携带的mRNA，这些mRNA似乎很长。为了可视化不同细胞来源的EVs之间mRNA载货量的差异，将EVs转录组绘制在一起，并对该数据集进行聚类。 B.除了子宫源性EVs外，不同细胞组EVs转录组之间的关联与其细胞转录反应相似，HEK和上皮细胞EVs分离MSC和免疫细胞源性样本。 C.接下来，通过对每种EVs类型进行差异表达分析，确定了它们中一致富集或缺失的转录。比较这些基因发现，除了在不同条件下培养的HEK细胞外，来自同一细胞源组的EVs携带相对重叠的转录本。为了追踪不同剂量下EVs的相对细胞关联，评估了每种EVs中最丰富但在对照成纤维细胞中不表达的转录本的存在。正如预期的那样，这表明用最低剂量的EVs处理的细胞往往含有最少的EVs衍生转录本。 D.然而,大多数在高剂量下，EVs类型并没有增加其转录本与靶细胞的关联，因为在高剂量下，12种EVs类型中的8种几乎没有变化，甚至更低。四种EVs类型的转录本在对照细胞水平上表现出剂量依赖性的增加，它们来自Panc-1、HAEC、THP1和Jurkat细胞。当分析之前发现在每种EVs类型中特异性富集的不相关转录本时，这种关联模式也成立。 本文小结： 综上所述，外泌体领域有一个特点，就是外泌体应用领先于对外泌体基础研究，于是外泌体应用也受制于基础研究的缺乏。本文研究给药剂量与外泌体来源对受体细胞的影响，并且提出外泌体应用需要着重考虑剂量因素，例如高剂量下，无论是何种细胞来源外泌体都只影响受体细胞溶酶体相关功能，而只有在低剂量下才能展示出不同细胞来源外泌体的特异性。此外，外泌体内部载药很难影响受体细胞（只有免疫细胞来源外泌体稍微好一些），相比之下，外泌体表面装载更好实现其功效。总之，不同类型载药需要考虑外泌体的细胞来源和用药剂量。 参考文献： Hagey DW, Ojansivu M, Bostancioglu BR,The cellular response to extracellular vesicles is dependent on their cell source and dose. Sci Adv. 2023 Sep;9(35):eadh1168. https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adh1168 |
