IF 16.6 Nature Communications|基因编辑器多重复合在成体干细胞衍生的类器官内一步生成肿瘤模型前言： 2023年8月17日，荷兰皇家艺术与科学院、KNAW和乌得勒支大学医学中心Maarten H.Geurts课题组在Nature Communications发表题为“One-step generation of tumor models by base editor multiplexing in adult stem cell-derived organoids”的研究论文。该研究通过基因编辑器多重复合在成体干细胞衍生的类器官内一步生成肿瘤模型，解决了肿瘤模型构建的复杂性和耗时性问题，并成功模拟了肝细胞、子宫内膜和结肠肿瘤的发生过程，为肿瘤研究提供了重要工具和方法。
背景介绍： 成体干细胞衍生（ASC）类器官大多数源自上皮组织，可以作为2D细胞系和体内动物模型之间的桥梁。肿瘤研究可以从类器官技术中受益，通过建立患者来源的肿瘤类器官库，可以在体外模拟肿瘤发生，并为患者提供个性化治疗的可能性。以往的基因组工程方法在构建人类癌症模型方面存在一定的挑战。为了模拟感兴趣组织的野生型类器官中的肿瘤引发突变，需要逐步引入突变，这是一项耗时的工作。CRISPR/Cas 9已成为基因组工程的有效策略，并已成功应用于包括类器官在内的模型系统，以研究肿瘤发生。在CRISPR/Cas 9介导的基因组工程中，效应蛋白Cas 9通过单个引导RNA(sgRNA)分子引导至需要的靶位点。Cas 9基因组定位由原型间隔子相邻基序(PAM)界定，对于SpCas 9来说是NGG，而SpCas 9的进化变体可以耐受更广泛的PAM序列。目标识别后，DNA链在R环中打开并单独切割，从而导致双链断裂(DSB)，随后通过非同源末端连接(NHEJ)机制修复，DSB可导致在断裂位点获得或丢失碱基对时基因敲除。虽然外源DNA可以通过同源定向修复(HDR)机制插入靶位点，但成功插入外源DNA的情况相对较少，并且很可能伴随着第二个等位基因的丢失。然而，通过DSB进行基因组工程也存在缺点。Cas 9引入的DSB修复被证明容易出错，并可能导致修复位点发生复杂的重排，包括染色体碎裂。为了规避这些问题，最近开发出了避免DSB的策略。将胞苷脱氨酶（rAPOBEC1）与部分失活的缺口酶-Cas 9(D10A)蛋白融合，可产生胞苷碱基编辑器（CBE），通过尿嘧啶中间体实现C>T碱基变化。将腺嘌呤脱氨酶（一种进化的TadA异源二聚体）与缺口酶-Cas 9结合可产生腺嘌呤碱基编辑器（ABE），通过肌苷中间体介导A>G碱基变化。碱基编辑构建体中与Cas 9融合的脱氨酶作用于单链DNA。因此，碱基编辑器仅在Cas 9目标识别时生成的单链R环的小窗口内起作用。这个有限的编辑窗口大约是原型间隔子5'端位置4和8之间四个核苷酸的大小，这表明需要对CRISPR/Cas 9复合物进行特定定位。由于碱基编辑无需有害的DSB即可介导遗传变化，因此它们代表了一种有前途的临床应用基因组工程工具。之前的研究表明，在囊性纤维化患者来源的类器官中使用ABE来功能性修复CFTR中的突变，而不会出现全基因组脱靶。尽管在基因组工程领域取得了这些进展，但忠实再现遗传学的癌症模型的产生人类癌症的研究一直非常具有挑战性。虽然研究人员和其他人之前已经证明CRISPR/Cas 9介导的基因组工程可以应用于类器官来研究肿瘤发生，但涉及多个基因突变的复杂基因型建模。本文讨论了在成体干细胞衍生的类器官中应用碱基编辑器生成肿瘤模型的应用。CRISPR/Cas 9介导的基因组工程的优化导致了碱基编辑器的发展，这对于突变修复和疾病建模具有潜力。文章展示了在肝细胞类器官中建模CTNNB1热点突变和在子宫内膜类器官中建模PTEN突变的碱基编辑器的使用。文章还探讨了SpCas 9和SaCas 9的组合，用于在单个步骤中同时编辑个体靶位点以及结直肠肿瘤发生的建模。成体干细胞衍生的类器官被强调为研究健康和疾病人类组织的重要工具，包括肿瘤学研究。患者来源的肿瘤类器官模型被讨论作为研究肿瘤发生和测试药物疗效的体外模型。提到了通过双链断裂（DSBs）进行基因组工程的局限性，并描述了避免DSBs的碱基编辑器的开发。文章通过介绍在人类类器官中创建与癌症相关的单碱基变化的一步策略来结束。 图文解析：
图1 要点1： a.由CTNNB1基因编码的蛋白在n端存在突变，这与CTNNB1被CK1和GSK3激酶降解，及被e3连接酶β-TrCP破坏蛋白酶体的原理有关。 b.CTNNB1外显子3引入突变的3个sgRNA的设计。sgRNA-1可与SpCas 9-ABE联合引入引物激酶突变S45P,sgRNA-2可与SpCas 9-ABE联合引入D32G或与SpCas 9-CBE联合引入S33F,sgRNA-3可与SpCas 9-NG-ABE联合引入T41A。c.设计了sgRNA，与CBE或ABE结合，可以诱导CTNNB1突变，从而阻止E3连接酶依赖性降解。 d.通过将S45残基突变为脯氨酸（以下称为S45P突变）来干扰CK1介导的CTNNB1磷酸化。pCMV-SpCas 9-ABEmax与sgRNA-1共转染导致23个克隆中有9个具有纯合子S45P突变(约40%)。 e.通过靶向T41、S33和D32残基，破坏了GSK3介导的磷酸化级联。将Cas 9变体pCMV-SpCas 9-NG与sgRNA-2共转染，在21个克隆中发现了3个同源突变（约14%）和1个异源突变（约5%）的T41A突变。 f.将pCMV-SpCas 9-ancBE4max与sgRNA-3共转染会导致20个克隆中的4个（20%）出现同源S33F突变。 g.这些S33F克隆都在上游两个碱基（c.96C>T）处有一个额外的诱导点突变，尽管是沉默的（D32D）。将sgRNA-2与pCMV-SpCas 9-ABEmax共转染会导致20个克隆中出现2个杂合（10%）和7个同源（35%）D32G突变。 h-k.CTNNB1突变的器官组织在细胞核中的表达量增加，表明beta连环素转移到细胞核中以激活下游靶基因。
图2 要点2： a.在癌症患者中观察到的CK1引发残基(S45P)突变的丰度几乎是E3泛素连接酶残基(D32)的两倍b-c.与野生型类器官相比，在细胞核中观察到的β-连环蛋白免疫荧光增加，其中S45P和D32G突变导致β的核定位类似增加。 d.CTNNB1主要是位于野生型类器官的质膜上，可能与黏着连接结合，而细胞质和细胞核中的细胞内水平较低。 e.连接酶识别中的突变结构域（D32G）细胞内定位增加。相反，含有纯合S45P突变的类器官显示质膜上的CTNNB1水平降低，细胞质和细胞核中的CTNNB1含量增加，与“过度激活”表型一致。 f.E3连接酶识别中的突变结构域（D32G）细胞内定位增加 g.与野生型对照组相比，两个点突变细胞质/细胞核和质膜中CTNNB1平均强度的比值均增加，并且进一步激活Wnt信号传导。 j-k.为了更好地理解S45P突变和D32G突变对下游基因转录的不同影响，比较了两种基因型，发现D32G突变体中178个基因不同程度地富集，而S45P背景中185个基因不同程度地富集。这些基因中有几个是转录因子和已知的Wnt靶基因，包括ATF3、LEF1和HNF4A。 h-i.对D32G背景中富集基因列表的基因本体分析揭示了“质膜”细胞区室的显着上调。其中包括钙粘蛋白17等基因，其靶向失活会导致Wnt通路激活减少。总而言之，该结果结果证实CTNNB1第三外显子中的热点突变会导致显著的Wnt通路激活，而且传统形式和进化形式的Cas 9都可以通过ABE和CBE在人ASC衍生的器官组织中引入点突变。
图3 要点3： a.磷酸酶及张力蛋白同源蛋白(PTEN)是EC中最常突变的基因，根据COSMIC，其在不同肿瘤类型中突变的相对数量最高。通常在肿瘤发生的早期观察到PTEN突变，而完全缺失被认为是晚期事件。 b.PTEN蛋白在分别介导其磷酸酶活性和质膜定位的两个主要结构域内包含突变热点。 c-d.pCMV-AncBE4max-P2A-GFP与sgRNA共转染后，20个克隆中有15个（75%）出现了Q245*同源突变。 e.在19个克隆中的3个（约占11%）引入R130*杂合突变，从而克服了建立早期子宫内膜肿瘤发生模型的主要瓶颈。 f.评估了PTENQ245*和PTENR130*对子宫内膜器官组织的影响。对这两种突变体的组织学检查显示，这些器官组织保留了与WT器官组织类似的囊性形态。研究人员证实，PTEN突变体的PTEN蛋白表达下调，PTEN/PI3K通路的下游效应因子mTOR表达增加，突变体细胞核中检测到其磷酸化增加。 g-h.与野生型器官组织相反，研究人员观察到PTEN/PIK3CA突变体对mTOR抑制剂Everolimus的敏感性降低，这可能是由于突变体器官组织中mTOR信号输出增加所致。
图4 要点4： a.pCMV-AncBE4Max-P2A-GFP与sgRNA共同转染，在扩增培养基中经过5天的恢复期后，R-spondin1和Wnt-3A被敲除。 b.在该选择培养基上14天后，类器官在没有Wnt的情况时生长。 c.对无Wnt生长的器官组织进行的Sanger测序显示，使用APCQ1406*和APCR1114*sgRNA都能正确引入突变。 d.克隆扩增后的Sanger测序显示，APC和TP53都出现了预期的终止密码子突变。 e-g.克隆扩增后对20个克隆进行Sanger测序，发现5个杂合型（25%）和15个同源型（75%）E545K突变，突变导入率为100%（图4e-g）。研究人员通过功能选择APC（去除Wnt）和TP53（添加Nutlin-3）的突变来评估E545K引导的效率，对PIK3CAE545K突变进行了基因分型。 h.分析显示，16个克隆中有8个同源突变（50%）和6个异源突变（37.5%），总编辑效率为87.5%。
图5 要点5： a.将SaKKHCBE与SpCas 9-ABE复用，可以同时进行A>G和C>T编辑，而不会干扰任何一个靶位点的sgRNA。 b.用pCMV-AncSaKKH-BE4Max结合靶向TP53中Q38*或Q52*的sgRNA转染的器官组织，经过14天的Nutlin-3处理后没有观察到任何器官组织存活，而靶向Q317*的sgRNA则诱导了一些器官组织的生长，但生长程度有限。 c-d.其余的克隆至少在其一个等位基因上含有插入缺失突变，这是研究人员在使用SpCas 9-CBE时未观察到的情况。 e.对用pCMV_SaKKH_BE4Max和TP53Q165*sgRNA转染的35个Nutlin抗性克隆进行基因分型，观察到5个克隆含有C > A，5个克隆在至少一个等位基因的残基S164上含有C > G突变，两者都引入了终止密码子插入。 f.应用sgRNAs引导SaKKH-CBE转染TP53W146*，SpCas 9-ABE转染先前描述的CTNNB1S45P突变，从而在肝细胞器官组织中复用SaKKH-CBE/SpCas 9-AB这两个碱基编辑器。通过去除Wnt激活剂Chir和R-spondin1，并加入Nutlin-3，在双重表型选择开始14天后，器官组织生长出来。 g-i.56个APC-sgRNA-3靶向的克隆在1127位带有终止密码子（Q1127*），表现优于其他APCsgRNA。桑格测序发现，28个克隆中有4个杂合型和1个同源型PIK3CAH1047R突变。
图6 要点6： a.单个APCQ1406*突变体具有严格的囊性形态，而用4种sgRNA混合物转染的类器官则表现出多种囊性和致密形态。 b-c.所有96个克隆都含有APC突变。其中两个包含插入缺失，而不是预期的C > T突变。PIK3CA的Sanger测序显示66个纯合子（约69%）、20个杂合子（约21%）、2个带有插入缺失的克隆，其余8个克隆为WT。TP53的Sanger测序显示25个纯合子(26%)、35个杂合子(36%)，其余36个克隆为WT。最后，SMAD4基因分型显示12个纯合子(12.5%)、22个杂合子(~23%)、1个插入缺失，其余61个克隆为WT。 d.观察到4个单APC突变体、24个双突变体、46个三重突变体和22个四重突变体，96个克隆类器官生物库在遗传学上概括了结直肠肿瘤发生的每个步骤。 e.虽然APC/PIK3CA突变体保留了囊性形态，但基于明场图像分析，添加SMAD4和TP53突变导致类器官具有更致密和复杂的表型。 f-g.设计了一种sgRNA，它可以与识别NGTPAM的Cas 9CBE变体共同工作。所有32个克隆都存在APC同源突变。观察到krasg12有两个不同的突变，即KRASG12N和KRASG12S。 h.2个类器官基因型中，32个都有PIK3CAE545K突变，12个有SMAD4R361H突变，24个有TP53W53*突变。这些数据表明，进化的Cas 9变体可用于扩大器官组织中肿瘤模型的目标范围。通过使用这些能识别替代PAM基序的Cas 9变体，可以创建从基因型上反映肿瘤发生不同阶段的类器官模型。 本文小结： 综上所述，该研究探索了在肿瘤建模中同时应用Cas 9 CBE和ABE的方法。研究人员使用Sa-CBE与Sp-ABE一起克服了使用相同的Cas 9同源体进行C>T和A>G突变的问题。研究人员成功地使用Cas 9同源体多重化引导C>T突变的TP53和A>G突变的CTNNB1。SaKKH-CBE对C>T突变的编辑效率更高，但在一些克隆体中观察到了非预期的编辑。研究人员还展示了SaKKH-CBE靶向TP53和APC以及SpCas 9-NG靶向PIK3CAH1047R的多重化，结果引入了预期的突变。Sanger测序确认了PIK3CAH1047R位点中的杂合突变。 参考文献： Geurts, M.H., Gandhi, S., Boretto, M.G. et al. One-step generation of tumor models by base editor multiplexing in adult stem cell-derived organoids. Nat Commun 14, 4998 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40701-3 |
