Nature Communications|病毒样颗粒修饰平台DIRECTED用于靶向胞质递送

前言

2023年8月23日麻省理工学院的张锋团队在Nature Communications杂志上在线发表了题为“Cell type-specific delivery by modular

envelope design”的研究性论文。通过对慢病毒的研究，发现其包膜蛋白同时具备膜融合和靶向作用，于是通过对包膜蛋白模块化改造，开发“DIRECTED”平台，构建病毒样颗粒，实现对多种细胞的靶向胞质递送。

背景

传统靶向递送载体就是腺相关病毒AAV，不同血清型靶向脑或肌肉组织，此外还有慢病毒和外泌体等，通过表面装载病毒来源包膜蛋白或抗体，也可以进行靶向递送，其中最经典的病毒来源包膜蛋白就是VSV-G，来源于水泡性口炎病毒，靶向低密度脂蛋白受体，因为这种受体普遍存在于细胞中，所以被认为是没有靶向作用的，此外艾滋病毒的ENV蛋白靶向CD4⁺T细胞，狒狒内源性逆转录病毒BaEV包膜蛋白可以靶向人T细胞、B细胞和CD34⁺细胞，狂犬病毒包膜蛋白RVG靶向神经细胞。

图1

要点1：

在病毒和病毒样颗粒(VLPs)从细胞中组装的过程中，膜蛋白可以被整合到病毒包膜中。慢病毒载体的生产通常是通过瞬时转染生产细胞的质粒来实现的，质粒编码包膜蛋白，如VSV-G，以及编码慢病毒基因的辅助质粒。

a.由此产生的病毒载体随后可以应用于受体细胞，其中细胞靶向进入分别由包膜受体相互作用和内体过程介导，从而成功地将转基因传递到表达同源受体的细胞中。

b.HLA-A2是一种膜蛋白，属于人白细胞抗原(HLA)家族。该家族的成员与不变的β-2微球蛋白(B2M)蛋白形成异源二聚体，形成MHC I类分子。这些分子存在于脊椎动物所有有核细胞的表面。如果B2M丢失，MHC I类分子就不能形成，因此，它们不会出现在细胞表面。转导4天后流式细胞术分析显示，添加αHLA-A2抗体导致VSV-G:pAG比例在95:5和25:75之间的H2B-mCherry阳性细胞比例更高，而敲除B2M的HEK293FT细胞未观察到增加。

C.在前期工作的基础上，对VSV-G与LDL-R15相互作用的关键残基( H8、K47、Y209、R354)进行了突变。对获得的单突变体的物理效价和功能滴度进行评估，发现生产效率降低了约50%，其中K47和R354的突变导致感染力的降低最强，与之前的报道一致。

d.为了进一步降低残余传染性，将K47或R354突变与其他导致传染性降低的突变结合起来。发现了两个双突变体，K47Q/R354Q和H8A/R354Q，在保持高产量水平的同时，表现出极弱的侵染能力。将VSV-G K47Q/R354Q双突变体(由此可知VSV-Gdm)与pAG和αHLA-A2抗体结合，检测其对HEK293FT细胞细胞的感染情况。这种策略导致在抗体存在的情况下野生型细胞的高转导，而在没有抗体或B2M敲除细胞上的最低转导。

图2

要点2：

a.接下来，通过改变抗体与病毒颗粒的比例来优化抗体量对成功递送结果的影响。使用Jurkat E6 T细胞，在其表面证实了典型T细胞特异性表面标志物(CD3和CD5)的表达，滴定了VSV-Gdm和pAG修饰的携带EF1α-H2B-mCherry转基因的慢病毒颗粒的量与抗体量的关系。

b.为了评估DIRECTED的特异性，建立了Jurkat E6和K562不同比例的共培养，比例在1：99到99：1之间。在Jurkat靶向抗体(αCD3)存在的情况下，在K562靶向抗体(αHLA-A2)存在的情况下，或者在没有任何抗体的情况下，用DIRECTED慢病毒颗粒感染细胞。发现，即使在低的靶细胞比例下，也会转导高比例的靶细胞，而脱靶感染并没有超过在没有抗体的情况下观察到的水平。

图3

要点3：a.使用荧光激活细胞分选(FACS)，根据这些细胞的表面HA表达水平将它们分为低、中低、中高和高四组。然后，用每种抗体动员策略(即scFv、pAG和SNAPtag)制作了定向慢病毒载体。b.为了探究抗体介导的DIRECTED递送的稳健性，使用不同抗体，使用pAG - DIRECTED或SNAP - DIRECTED病毒颗粒，在同一细胞类型上测试了不同合成受体的靶向性。首先建立了表达共同蛋白标签作为合成表面受体的细胞系。然后，将这些细胞系与pAG-DIRECTED病毒颗粒共孵育，在没有任何抗体或存在针对不同标签的抗体的情况下。C.这导致只有匹配的表面标签和抗体组合才能成功转导。类似地，我们用SNAP - DIRECTED病毒颗粒询问这些细胞系，同样只观察到匹配表面标签和抗体对的有效递送。

图4

要点4：

a.尽管VSV-G假型载体是体外应用的良好选择，但据报道，由于人血清蛋白的失活，VSV-G在体内的功能受到限制39,40。此外，单轮体内注射VSV-G假型颗粒诱导的体液免疫以及对VSV-G的预先免疫可能会给临床应用带来问题。因此，为了试图确定与DIRECTED兼容的其他ph依赖性融合原。研究人员使用psiBLAST对VSV-G进行了基于序列的同源性搜索。这项研究揭示了来自横纹肌病毒科的多个序列相关的融合原，包括水泡性口炎病毒的多个分离株。

b.为了评估该家族的其他成员是否与DIRECTED兼容，选择了之前用于假型慢病毒颗粒的Cocal virus G，该假型慢病毒颗粒对人血清灭活更具抗性。预测的局部病毒G的结构与VSV-G单体的预测结构相似。

C.在结构比较的基础上，构建了一个Cocal virus G受体结合突变体，预测其可以消除与细胞受体的相互作用，并测试了其在pAG-DIRECTED慢病毒颗粒上转导HEK293FT细胞细胞的性能。在有αHLA-A2抗体存在的情况下，观察到高水平的转基因递送，而在没有抗体的情况下，活性很低。

d.发现约25%的构建体至少能转导一种被测试的细胞系，但只有少数融合原表现出内在的细胞类型特异性趋向性。接下来，使用pAG靶向策略在HEK293FT细胞上测试了野生型融合原库。αHLA-A2抗体的存在导致15种被检测的融合原感染增加，所有这些融合原都是四个家族(丝状病毒科、正粘病毒科、Rhabdoviridae和Togaviridae)的成员，并且有报道使用ph依赖的融合机制。

e.利用AlphaFold2预测Dhori索戈托病毒属GP、QRFV_Hyp和杆状病毒GP64的结构，比较它们的整体折叠情况。三种蛋白的融合结构域均显示融合环中疏水性氨基酸的高度保守性，这使得蛋白能够插入到靶膜中并诱导膜融合。

f.为了评估GP64与DIRECTED的兼容性，制备了未修饰的GP64和pAG修饰的慢病毒载体，并在HEK293FT细胞上进行了检测，发现在抗体存在的情况下，转导能力显著增强。

g.这些发现表明，DIRECTED除了与多个靶向成分兼容外，还可以与来自不同病毒家族和物种的多种融合性成分一起工作。

图5

要点5：

a.发现αCD5-BG SNAP-DIRECTED CreVLPs在这些细胞中有效地诱导了GFP的表达，而在缺乏抗体的情况下，没有检测到GFP的表达。

b.发现αCD5DIRECTED颗粒导致所有测试包膜的B2M蛋白的有效损失，而没有抗体或非靶向指导的颗粒显示出最低的敲除效率。

C.接下来，要测试pAG或SNAP - DIRECTED颗粒靶向不同天然受体的能力。首先用靶向CD3或CD5的VSV-Gdm+pAG-DIRECTED颗粒，发现与没有抗体的对照相比，两种抗体都能有效地降低B2M水平。然而，CD5导向的颗粒显示出比CD3导向的颗粒更低的有效性。

图6

要点6：

a.为了测试定向慢病毒载体是否可以在复杂环境中靶向特定的原代细胞，纯化了由多种不同细胞类型组成的外周血单个核细胞(PBMCs)。

b.随后用这些载体转导PBMCs，发现VSV-Gdm+αCD3和VSV-Gdm-Tcell载体能有效转导静息的人T细胞，而VSV-Gdm+SNAP和VSV-Gdm-Bcell不能转导静息的人T细胞。

C.发现在两种B细胞靶向条件下，H2B-mCherry阳性的B细胞均增加，而在VSV-Gdm-B细胞条件中，无法检测到H2B-mCherry阳性的T细胞。

d-e.接下来测试了全血中的T细胞靶向，这为基因治疗载体增加了多个额外的障碍，如中和抗体，补体成分和吞噬细胞。将慢病毒载体与野生型VSV-G、VSV-Gdm+无抗体的snapdirected颗粒或功能化变体(VSV-Gdm-Tcell:αCD3、αCD28、αCD4;VSV-Gdm-αCD3)。病毒与血样共孵育6小时后，去除红细胞，将纯化后的细胞与T细胞激活剂珠孵育，激活T细胞，使其增殖和存活。在转导后第6天，通过流式细胞术分析细胞，发现两种T细胞靶向组合都成功感染了T细胞，感染水平与野生型VSV-G相似或更高。

小结

综上所述，通过“DIRECTED”平台构建一种模块化慢病毒载体，通过替换病毒表面的靶向分子和膜融合蛋白，可以实现多种靶向功能和效应分子递送，同时作者开发三种表面抗体修饰方法（共价修饰或非共价修饰），证明多种不同种属来源的膜融合蛋白都可以与之兼容，同时也证明高效递送蛋白和小核酸。

参考文献：Strebinger, D., Frangieh, C.J., Friedrich, M.J. et al. Cell type-specific delivery by modular envelope design. Nat Commun 14, 5141 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40788-8