IF17.694 Nature Communications│HDAC2和SMAD3-SKI之间的表观遗传和分子协调调节脑肿瘤干细胞的基本特征

前言

2023年8月16日，加拿大卡尔加里大学的研究团队在Nature Communications发表“Epigenetic and molecular coordination between HDAC2 and SMAD3-SKI regulates essential brain tumour stem cell characteristics”的研究论文。研究了特定组蛋白脱乙酰酶在维持胶质母细胞瘤 (GBM) 脑肿瘤干细胞(BTSC)亚群关键自我更新和生长特征中的相关作用。

背景介绍

组蛋白脱乙酰酶(HDAC) 是一种具有沉默基因表达功能的表观遗传调节因子，在胶质母细胞瘤(GBM)在内的癌症干细胞功能中发挥重要作用。HDAC 在正常干细胞或引发的祖细胞环境中调节多种表观遗传过程，类似的过程也在癌症中发挥着作用，并且已有相关报道描述了泛 HDAC 抑制剂对 GBM 和其他癌症的潜在治疗益处。然而，泛 HDAC 抑制剂缺乏特异性，会导致大量副作用和毒性。因此，仍然需要鉴定和验证不同疾病背景下最相关的 HDAC 酶，进而开发特定的 HDAC 抑制剂。

图文解析

图1

要点1：

a-b.评估了代表不同遗传背景的BTSC细胞系中I类(HDAC1、2和3)和II类(HDAC6和9)HDACs的蛋白水平、正常人类诱导多能干细胞(hiPSCs)、正常神经干细胞(NSCs)、来自hiPSCs的星形胶质细胞和来自正常人类胎儿神经干细胞(HF NSCs)的星形胶质细胞。发现与hiPSCs或HF NSCs衍生的星形胶质细胞相比，I类HDAC在BTSC细胞系中高表达。HDAC1和2 (HDAC1/2)在hiPSCs、HF NSCs和BTSC细胞系中的表达是相似的。HDAC2在hiPSCs衍生的NSCs中表达也很高，但在其分化的星形胶质细胞衍生物中表达较低，

c-f.为了进一步确定I类HDAC在BTSC中的功能相关性，与其他类相比，pan-HDAC和I类和II类特异性HDAC抑制剂(4SC202、moceinostat、RGFP966、romidepsin和WT161)在9个BTSC细胞系和正常人胎儿星形细胞((HFA)中进行了测试。发现泛HDAC抑制剂和其他特异性HDAC抑制剂相比，HDAC1/2特异性抑制剂罗米地辛在较低浓度(300-1000pM)下降低了BTSC活力。

图2

要点2：

a.在mRNA和蛋白水平上验证了这些表达变化，并证实罗米地辛处理导致SOX2和OLIG2下调，BDNF、GFAP和STX3上调。这些变化与细胞周期调节因子p21和p38蛋白水平的增加有关，已知p21和p38可诱导细胞周期阻滞。这些数据进一步支持了HDAC1/2抑制后BTSC自我更新、细胞形态和细胞周期进展的变化。

b.通过western blot也证实，罗米地辛与载药处理的样品相比，磷酸化SMAD3和SKI蛋白水平降低，NEDD4L和抑制性SMAD蛋白SMAD7水平升高。此外，在罗米地辛治疗后，观察到泛素化-SMAD3水平的增加。上述数据表明，罗米地辛处理后，NEDD4L的mRNA和蛋白质丰度增加，可能有助于泛素介导的降解和BTSCs中总蛋白和磷酸化SMAD3蛋白的相关减少。

c-f.对H3K27ac进行了ChIP测序，以评估罗米地辛治疗后BTSC干性、分化和TGF-β通路相关基因差异表达基因5’调控区H3K27ac状态的变化。在罗米地辛处理的细胞中，观察到干细胞基因SOX2的5’调控区域以及TGF-β通路相关基因SMAD3和SKI的H3K27ac水平降低。

g-h.BDNF基因5’调控区H3K27ac水平也有小幅升高。这些H3K27ac水平的变化通过ChIP-qPCR在罗米地辛处理与载体处理的BTSC样品中得到验证。i-j.由于BDNF基因5 '调控端的H3K27ac水平几乎没有变化，接下来想知道HDAC1/2调控的H4赖氨酸乙酰化是否也可能导致观察到的基因表达变化。使用H4K5ac ChIP-PCR，发现罗米地辛治疗后BDNF 5 '端的H4K5ac水平显著上调。进一步发现，罗米地辛治疗导致SMAD3基因5 '区域的H4K5ac水平显著降低，这可能是其转录抑制的部分原因。

图3

要点3：

a-c.使用CRISPR-Cas9技术与两种不同的引导RNA一起靶向HDAC1/2基因组位点以及AAVS1靶向对照gRNA。与AAVS1对照相比，这两种引导RNA在降低BTSCs中HDAC1/2蛋白水平方面同样有效。

d-e.进一步评估HDAC1/2的单、双KO对BTSCs活力的影响发现，虽然HDAC1 KO显著降低BTSCs活力(约40 % )，但与AAVS1对照BTSCs相比，HDAC2 KO BTSCs中细胞活力的损失更加剧烈(约60 %)。

f.此外，具有HDAC2 KO的S期细胞的百分比减少更大与AAVS1对照和HDAC1 KO细胞的比较。引人注目的是，在细胞周期的G2/M期阻滞的细胞百分比的显著增加是HDAC2 KO BTSC所特有的。总的来说，这些数据表明HDAC2在体外维持BTSC活力、干细胞性和细胞周期进展方面比HDAC1更重要。

g.接下来，研究HDAC1/2调控BTSC生长的表观遗传机制。与AAVS1对照相比，KOs靶向HDAC1/2位点的BTSCs中H3和H4赖氨酸乙酰化水平升高。有趣的是，HDAC2 KOs中H4K5ac和H3K18Cr水平的整体升高高于HDAC1 KOs。利用H4K5ac ChIP-seq对AAVS1和HDAC2 KO BT67细胞中HDAC2特异性组蛋白修饰的功能相关性进行进一步研究发现，H4K5ac在SOX2、OLIG1/2、SMAD3和SKI基因的5 '调控区域的富集水平下降。

h-m.此外，H4K5ac在BDNF、L1CAM、NEUROD1/2、NEFH和STX3等分化标志物的调控区域获得了更广泛的结构域，并通过ChIP-qPCR进行验证。同样，在SOX2、SMAD3和SKI的5 '区，H3K27ac的富集水平降低，而在BDNF基因的5 '端，特别是在HDAC2 KO BTSC中，H3K27ac的富集水平升高。

图4

要点4：

a.小鼠原位异种移植HDAC1 KO p53野生型BT67细胞显示中位生存期改善(p< 0.0008)。与AAVS1对照和HDAC1 KO异种移植相比，原位移植BT67 HDAC2 KOs细胞的小鼠的中位生存期得到了更大的改善。

b.此外，与各自的无序对照小鼠相比，无论p53状态如何，原位移植HDAC2 KD BT147和BT67细胞的小鼠的中位存活率显著增加。

c-f.利用免疫共沉淀(co-IP)检测HDAC1、HDAC2和SMAD3抗体，发现HDAC2与SMAD3和SKI蛋白结合蛋白，而不是HDAC1蛋白结合蛋白。没有观察到HDAC2与SMAD2和其他负调节蛋白(如SNON)的任何相互作用。

g.进一步用原位接近结扎试验(PLAs)证实了这些发现。结果显示，与抗HDAC2 +抗SMAD3样本相比，抗HDAC2+抗SMAD3样本和抗SMAD3+抗SKI样本中每个核内PLA焦点的数量显著增加，而在romidepsin处理24 h后，这些PLA焦点的数量相对于溶剂对照组减少，经罗米地辛处理24小时后，抗HDAC2+抗SMAD3样品的PLA焦点数量相对于对照物。这些数据表明，HDAC2可能是BTSC中SMAD3-SKI的结合伴侣。

h.使用抗标记抗体的Co-IP测定显示，相对于SMAD3C或空载体表达细胞，表达MH1结构域的HEK293T/17细胞的克隆，特别是SMAD3NL，其溶解物中HDAC2蛋白的拉降增加。

i.同样，表达HDAC关联域的HDAC2N克隆，与表达HDAC2克隆或空载体的HEK293T/17细胞的裂解物相比，显示出与SMAD3的结合增加。

图5

要点5：

a.通过芯片测序来了解HDAC2和SMAD3-SKI调控的合作机制，并确定共同的靶基因。ChIP-seq数据显示，BTSC基因组中HDAC2和SMAD3结合峰的重叠程度大于HDAC1。

b.进一步对HDAC2和SMAD3重叠峰进行基序富集分析，发现SMAD3、NEUROD1和SOX家族相关结合基序富集的重叠序列比例更高，表明在BTSC中表现出这些基序的基因受HDAC2和SMAD3的协同调节。

c-f.来自RNA-seq数据的差异表达转录本包括BDNF、L1CAM、NCAM1;细胞周期基因如CDKN1A/p21;以及TGF-β通路相关基因，包括NEDD4L和SMAD7，显示HDAC2和SMAD3在其基因组区域内富集。相反，SOX2和SKI的5 '调控区域显示SMAD3结合增加，而HDAC2在L1CAM基因的基因组区域结合增加。

h-k.ChIP-qPCR进一步验证了这些结果。结果表明，HDAC2和SMAD3共同调控BTSC细胞命运、细胞周期进程相关基因和TGF-β通路相关基因的表达。

图6

要点6：

a.与HDAC2-/Neg+对照细胞相比，SMAD3在HDAC2 KO BTSCs中过表达可挽救SOX2的表达。然而，相对于HDAC2-/Neg+对照细胞，HDAC2-/SMAD3+细胞中GFAP和BDNF的表达没有明显的恢复。与AAVS1对照的BTSC相比，HDAC2精通的BTSC (AAVS1/SMAD3+)中SMAD3过表达导致SOX2蛋白水平小幅升高，但BDNF和GFAP未发生变化。这些结果表明SOX2在BTSCs中的表达至少部分受到SMAD3的调控。

b.此外，相对于HDAC2-/Neg+对照细胞，SMAD3过表达显著挽救了HDAC2 KO BTSCs的球形形成频率。

c.细胞周期变化的进一步分析显示，与HDAC2-/Neg+细胞相比，HDAC2-/SMAD3+ BTSCs在细胞周期S期的百分比显著增加，并挽救了G2/M期细胞周期停滞。这些发现表明，SMAD3可以部分修复由HDAC2缺失引起的自我更新和细胞周期缺陷，这可能部分归因于SMAD3介导的SOX2表达的修复。

d.SMAD3抗体的co-IP测定，发现AAVS1/SMAD3+细胞有小幅增加，而HDAC2-/Neg+和HDAC2-/SMAD3+细胞中HDAC2没有下降，进一步支持HDAC2和SMAD3之间的关联在维持BTSC特性中的重要性。

e.SMAD3过表达介导的细胞周期进程的挽救是否也会在体内恢复HDAC2 KO BTSCs的致瘤潜能。将AAVS1对照、HDAC2-/Neg+、AAVS1/SMAD3+和HDAC2-/SMAD3+ BTSCs原位异种移植至SCID小鼠。观察到，与HDAC2-/Neg+异种移植小鼠相比，HDAC2-/SMAD3⁺异种移植小鼠的中位生存期显著降低。

图7

要点7：

a-c.通过CRISPR-cas9 KOs来评估靶向BTSC中SMAD3的重要性。发现干细胞标记物的蛋白质水平显著下降;相对于AAVS1对照BTSC, SMAD3 KOs中SOX2、OLIG2和SKI的表达，证实了ChIP-seq数据中SMAD3对它们的调控作用。HDAC2蛋白表达的小幅下降也被观察到，同时BDNF蛋白水平升高。观察到H3K27ac和H4K5ac标记水平进一步增加，这可能归因于HDAC2蛋白的减少。这反过来导致与AAVS1对照相比，SMAD3缺失的BTSC中HDAC2蛋白与SMAD3抗体的免疫沉淀减少，同时在BDNF基因5 '端富集水平降低。

d.此外，相对于AAVS1对照细胞，SMAD3 KO显著降低了BTSC的自我更新能力。这与体内研究结果一致，

e.原位异种移植SMAD3 KO BTSCs的小鼠相对于各自的AAVS1对照细胞显示出更高的总体存活率。这些发现证实了SMAD3通过HDAC2依赖性和非依赖性过程在调节BTSCs的干细胞和致瘤性特性中的作用。

f.在BTSCs和HFA中筛选了一种最近可用的抑制剂Santacruzamate A对HDAC具有高效能，以确定其治疗价值。发现Santacruzamate A的效力略低于罗米地辛，但足以在所有测试的BTSC系中降低纳摩尔剂量的细胞活力。

g-i.与罗米地辛治疗或基因敲除研究一样，Santacruzamate A治疗BTSCs导致HDAC2介导的组蛋白修饰、相关基因表达和TGF-β通路相关基因的调节发生类似的变化。这些发现进一步证实了HDAC2在BTSCs中的功能相关性。

图8

要点8：

a-c.在hiPSCs衍生的SOX2+/nestin+ NSCs中稳定地过表达HDAC2。有趣的是，NSCs中HDAC2的过表达导致SMAD3和SOX2蛋白同时上调，BDNF蛋白水平下调。进一步评估HDAC2过表达对NSCs自我更新能力的影响，发现与阴性对照相比，HDAC2+ NSCs中神经球的数量有小幅增加。最重要的是，与阴性对照NSCs相比，HDAC2+ NSCs接种5天后计数的细胞总数显著增加。

d.此外，EdU细胞周期分析显示，进入细胞周期S期的细胞百分比显著增加，同时进入细胞周期G0/G1期的细胞百分比下降。

e.由特异性染色质修饰和TGF-β通路SMAD3-SKI臂的调节驱动的HDAC2的这些多效性作用对于维持BTSC的干性表型和生长至关重要。

本文小结

综上所述，研究表明HDAC2和SMAD3-SKI之间的表观遗传和分子相互作用是维持BTSC关键功能特征所必需的。假设这种相互作用和其他这种相互作用可能不仅限于GBM BTSC，而且可能与其他癌症干细胞背景有关。研究结果表明，使用HDAC2特异性脑渗透小分子抑制剂破坏HDAC2-SMAD3-SKI轴，有可能成为一种有前途的全球治疗策略，用于靶向GBM中耐药和自我更新的BTSC群体。

参考文献：

Bahia, R.K., Hao, X., Hassam, R. et al. Epigenetic and molecular coordination between HDAC2 and SMAD3-SKI regulates essential brain tumour stem cell characteristics. Nat Commun 14, 5051 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40776-y