IF30.8  Nature Genetics│亲本组蛋白的对称遗传有助于保障小鼠胚胎干细胞在分化过程中的命运

IF30.8   Nature Genetics│亲本组蛋白的对称遗传有助于保障小鼠胚胎干细胞在分化过程中的命运

前言

2023年9月4日，中国科学院深圳先进技术研究院甘海云团队在Nature Genetics发表题为“Symmetric inheritance of parental histones   contributes to safeguarding the fate of mouse embryonic stem cells during differentiation”的研究论文，该研究发现Mcm2突变或Pole3缺失的小鼠胚胎干细胞(ESCs)表现出异常的组蛋白景观和受损的神经分化。

背景介绍

亲本组蛋白是翻译后修饰的载体，在依赖于DNA解旋酶的Mcm2亚基和DNA聚合酶的Pole3亚基的过程中，被均匀地沉积到姐妹染色单体的复制DNA上。亲代组蛋白增殖的生物学意义尚不清楚。

图文解析

图1

要点1：

a.主成分分析(PCA)表明，与WT相比，Mcm2-2A ESCs中H3K27甲基化图谱的改变程度大于其他PTMs。

b.为了检测亲本H3K27甲基化的DNA链特异性转移，监测Mcm2-2A突变体中新的H3K27甲基化恢复过程，研究人员在5-溴脱氧尿苷(BrdU)标记后0、8和24 h收集样品进行eSPAN分析。研究人员证实了H3K27甲基化在Mcm2-2A ESCs中复制引导链上的偏向性分布。

c.H3K27甲基化信号可以被Mcm2-2A或Pole3 KO与WT ESCs中的上调和下调区域分组。H3K4me3信号在相同的位点上没有改变。

d.然而，在Mcm2-2A ESCs中，研究人员没有观察到H3K27甲基化水平升高的基因在其转录起始位点(TSSs;± 2 kb)附近的表达有显著差异。

e.与H3K27甲基化信号上调相关的基因被富集到与神经发育相关的基因本体(GO)条目中，包括神经元投射发育、神经元分化和轴突生成，而与下调相关的基因H3K27甲基化信号富集到与激酶B信号和炎症反应相关的GO条目。

图2

要点2：

a.为了了解对称的亲本组蛋白分配是否在ESC分化中发挥作用，研究人员将WT、Mcm2-2A、Pole3 KO和Mcm2-2A Pole3 KO ESC克隆分化为神经前体细胞(NPCs)。

b.即使在晚期神经分化时间点(第16天)，大部分Mcm2-2A、Pole3 KO和Mcm2-2A Pole3 KO细胞仍未完全分化为Nestin阳性的NPCs。相反，研究人员观察到了缺乏结构双极性的非神经和神经元样细胞的异质性群体

c.在Mcm2-2A、Pole3 KO和Mcm2-2A Pole3 KO细胞中，成熟的NPCs标志物Nestin水平显著降低，表明这些细胞要么不是NPCs，要么是未成熟的NPCs，未能进行适当的神经分化。

d-e.通过观察Mcm2-2A细胞的神经分化缺陷表型，研究人员推测Mcm2-2A突变可能严重影响小鼠的生长发育。为了验证这一假设，研究人员构建了Mcm2-2A杂合子小鼠。研究人员进一步发现，纯合的Mcm2-2A突变导致着床前发育受损，从四细胞期开始，降低桑椹胚发育效率。

图3

要点3：

a.为了研究研究人员观察到的组蛋白修饰的初始差异是否会影响ESC的命运，研究人员结合了谱系追踪和单细胞信使RNA测序(scRNA-seq)，在单细胞水平上同时分析了转录组和谱系信息。

b-d.用Lineage and RNA recovery(LARRY)慢病毒条形码文库转导ESCs，然后沿神经谱系分化。取 第0天(ESCs)和第 7天(NPCs)的部分细胞进行10x Genomics scRNA-seq分析，剩余细胞进行克隆扩增和谱系追踪。利用t-分布随机近邻嵌入(t-SNE)，细胞根据其不同的转录组特征被分为6个簇。

e-f.为了注释这些簇，研究人员将定义良好的ESC标记(Pou5f1、Nanog、Sox2和Klf5)和NPC标记(Pax6、Fabp7、Nestin、Sox1、Hes5和Epha7)投影到t-SNE图上，发现ESCs主要被分配到簇 1，NPCs主要被分配到簇 2。

g.胚胎器官发育相关基因Hoxa1、Foxc2、Rdh10、Twist1和Lhx1与肌肉组织或间充质细胞发育相关基因Twist1、Foxc2、Rdh10和Gata6投影到 3簇验证了研究人员的分析。

h-j.为了更深入地了解分化的Mcm2-2A细胞，研究人员从簇 2(主要是WT NPCs)和簇 3(主要为Mcm2-2A NPCs)中获得了亚簇信息。而在 3基因簇中，分化的Mcm2-2A细胞被分为3个亚簇，每个亚簇具有明显富集的过程，揭示了转录组的异质性。

图4

要点4：

a.研究人员推测，亲本组蛋白分配的缺陷可能导致细胞间组蛋白景观的异质性，进而导致转录组的异质性。为了验证这一假设，研究人员使用创新的单细胞CUT&Tag(sc CUT&Tag)方法来分析ESCs中H3K27甲基化模式的异质性。

b-c.WT和Mcm2-2A ESCs根据其不同的H3K27甲基化图谱被分为11个簇。同时，为了更好地呈现WT或Mcm2-2A的聚类，研究人员分别对每个基因型进行了聚类分析。与两种基因型混合的数据一致，Mcm2-2A ESCs显示出比WT细胞更多的簇，表明H3K27甲基化具有高度异质性。

d.正如预期的那样，通过EVA统计评估，Mcm2-2A突变增加了ESCs中H3K27甲基化分布的通路异质性。

e.与研究人员的scRNA-seq分析一致，与Mcm2-2A细胞的H3K27甲基化scCUT&Tag标记峰相关的基因富集在神经谱系以外的GO条目，如头部、感觉器官、血管和胚胎发育。

图5

要点5：

a-b.研究人员发现Mcm2-2A突变增加了ESCs和NPCs的转录组异质性。

c.在Mcm2-2A细胞中H3K27甲基化水平升高的位点，转录组异质性比H3K27甲基化水平稳定的位点和低或高(管家基因)表达基因的位点更显著，无论是在ESC阶段还是分化后。

d.转录组异质性不仅在神经发育通路中被发现，在其他谱系分化通路中也被发现。

图6

要点6：

a.研究人员观察到Mcm2-2A细胞偏向于分化，与WT ESCs中观察到的自我更新和分化之间的平衡相反。

b.在转录水平上，Mcm2-2A ESCs表现出更多的分化样基因表达谱。

c.研究人员还观察到Mcm2-2A细胞在分化后倾向于形成超级克隆，而大多数WT细胞在由2-5个细胞组成的较小克隆中发现。

d.与这些观察结果一致，NPCs或NPC-like细胞构成了Mcm2-2A克隆中的大多数细胞。

e.这些结果表明，Mcm2-2A突变使ESCs偏向于分化，在分化因子存在的情况下有利于超级克隆的选择。

图7

要点7：

a.组蛋白H3.3在Mcm2-2A中表现出滞后链偏向性，在Pole3敲除的ESCs中表现出强烈的前导链偏向性，而在WT ESCs中表现出轻微的前导链偏向性。时间过程eSPAN分析表明，这些偏差在8 h内得到了恢复。

b.对已发表的数据集分析表明，H3K27甲基化上调区域富集了H3.3、Hira和PRC1/2复合物。

c-d.研究人员自己的H3.3CUT&Tag分析也显示这些区域的H3.3信号水平高于WT ESCs。

e-f.为了进一步证明H3.3在这一过程中的功能作用，研究人员还在Hira敲除的情况下进行了H3.3的eSPAN和H3K27甲基化CUT&Tag实验。研究人员发现，与单独的Mcm2突变相比，在Mcm2突变的基础上抑制Hira可以降低H3.3的偏向性，并且重要的是减少了H3K27甲基化的上调。作为对照，Hira KO ESCs在相同的位点没有表现出明显的H3.3偏向性或H3K27甲基化的改变。

g.因此，Mcm2-2A或Pole3缺失的ESCs表现出强烈的分化缺陷表型。

本文小结

综上所述，研究人员的数据表明，亲本组蛋白的分配通过关键的表观遗传抑制性标记H3K27甲基化调控小鼠细胞的分化和发育。这些发现证明了DNA复制偶联的组蛋白分配与细胞分化之间的直接联系。

参考文献：Wen, Q., Zhou, J., Tian, C. et al. Symmetric inheritance of parental histones contributes to safeguarding the fate of mouse embryonic stem cells during differentiation. Nat Genet 55, 1555–1566 (2023).

https://doi.org/10.1038/s41588-023-01477-w