Nature Communications│FAM3A通过调控KLF4泛素化修饰重塑腹主动脉瘤中VSMC命运特化

Nature Communications│FAM3A通过调控KLF4泛素化修饰重塑腹主动脉瘤中VSMC命运特化

前言

2023年9月2日，中国医学科学院北京协和医院血管外科和北京协和医院东城区血管外科等多个实验室联合在《自然通讯》（Nature Communications，IF16.6）发表研究论文《FAM3A通过调控KLF4泛素化修饰重塑腹主动脉瘤中VSMC命运特化》(FAM3A reshapes VSMC fate specification in abdominal aortic aneurysm by regulating KLF4 ubiquitination)。研究发现，FAM3A在AAA中作为VSMC命运塑造调节因子，并揭示了与KLF4泛素化和稳定性相关的潜在机制。

背景介绍

腹主动脉瘤( abdominal aortic aneurysm，AAA )的特征是腹主动脉的永久性和不可逆性扩张。AAA的患病率在世界范围内因种族和性别而异，AAA患者的总体死亡率较高。一般来说，AAA主要被描述为由炎症等获得性免疫过程驱动的主动脉完整性破坏。然而，AAA形成和进展的病因和病理生理机制尚不清楚。血管平滑肌细胞( vascular smooth muscle cells，VSMCs )作为主动脉壁中的大多数细胞，并不是终末分化的，在整个生命周期中保留着显著的可塑性。AAA病灶组织中的VSMC在微环境重塑的作用下发生多种异质性分化，即VSMC重编程，产生一系列细胞亚群。VSMC重编程对于血管成熟或损伤修复至关重要，但它确实与血管结构紊乱和血管疾病有关。

图文解析

图1

要点1：

a.HE染色显示平滑肌细胞排列紊乱，细胞外基质降解，炎性细胞浸润增加，Masson染色提示患者动脉瘤壁纤维化明显增加。

b-c.为了研究FAM3A在AAA中的表达变化，检测了FAM3A的蛋白和mRNA水平。与正常主动脉相比，AAA组织中FAM3A蛋白和mRNA水平显著降低。

d-h.两种动脉瘤小鼠模型均表现出动脉直径的显著增加和相应的病理生理变化；E为提示AngⅡ诱导的ApoE/AAA模型；

g.为弹性蛋白酶诱导的C57BL/6 AAA模型。此外，与AAA患者的研究结果一致，免疫荧光染色，蛋白质免疫印迹杂交和qRT - PCR证实了FAM3A在小鼠主动脉瘤组织中的表达水平较低。基于免疫荧光染色的共定位结果发现，FAM3A在小鼠主动脉中膜平滑肌细胞中大量表达。

图2

要点2：

a-c.鉴于FAM3A在主动脉瘤形成中的可能作用，利用FAM3A腺病毒在小鼠体内过表达FAM3A，发现与空载体病毒组( Ad-sham )相比，FAM3A过表达小鼠的动脉瘤直径显著减小，生存率显著提高。动脉瘤切片HE染色显示，FAM3A过表达组炎性细胞浸润程度明显低于对照组。此外，FAM3A过表达组血浆和AAA组织中白细胞介素IL1β、IL6和TNFα水平显著低于Ad-sham对照组。此外，FAM3A对AngⅡ诱导的血压升高无明显影响。

d.从AngⅡ灌注的

ApoE-/-动脉瘤组织的RNA测序数据中，鉴定了386个差异表达基因( DEGs )，与Ad-sham对照组织相比，FAM3A过表达组织中192个上调和194个下调。e.KEGG的功能富集分析揭示了一些可能与FAM3A和AAA相关的关键通路，包括代谢、PPAR信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用。

f-g.从KEGG数据库中提取了与VSMC表型转换和分化相关的基因，并比较了它们在两组小鼠中的表达水平。FAM3A过表达的主动脉中收缩型VSMCs标志性基因(包括Myocd、Srf、Myh11、Cnn1、Cnn2和Tagln)表达水平的降低。此外，FAM3A过表达组中Olfm2和Mkl1/Mrtfa的表达水平降低。

h-i.通过qRT-PCR进一步证明了一些显著的基因表达。在蛋白水平上，检测到类似的趋势和结果，提示FAM3A在挽救VSMC功能缺失表型中的潜在作用。然而，在AngⅡ诱导的ApoE-/-小鼠中，FAM3A过表达后，VSMC表型转换的关键调节因子KLF4在4周时间点的转录水平没有显著变化。

图3

要点3：

a.利用FAM3A重组蛋白，在AAA小鼠模型中验证了FAM3A的体内潜在保护作用。FAM3A在哺乳动物物种中具有高度的遗传保守性，因此使用人重组FAM3A蛋白进行小鼠给药是合理的,分组轮廓如图3a所示。

b.FAM3A对AngⅡ诱导的血压升高没有显著影响。

c.通过动态超声监测发现，在AngⅡ暴露后的第1周，FAM3A补充组的主动脉直径就显著小于匹配的PBS注射组。

d.在存活方面，补充重组FAM3A蛋白也导致了显著的改善。

e.与匹配的PBS组相比，添加FAM3A显著降低了血浆和AAA组织中的炎症标志物，如IL1 β、IL6和TNF α。

f.检测到FAM3补充小鼠主动脉组织中MMP2和MMP9的表达显著降低。此外，补充FAM3A可以恢复VSMCs的收缩表型。

图4

要点4：

a.在体内实验中，检测到CD68和ARG1 (巨噬细胞)，Aggrecan (软骨细胞)，OPN (成骨细胞)的表达水平显著降低。

b.αSMA⁺、CD68⁺、αSMA⁺、RUNX2⁺、α SMA⁺、CD34⁺和α SMA+LUM+细胞在AAA条件下被诱导，并且被腺病毒介导的FAM3A过表达逆转，表明FAM3A在体内抑制VSMC向其他中间细胞类型转分化的作用。

c.此外，VSMCs的特异性标志物( αSMA )和其他中间细胞类型( CD68为巨噬细胞, Aggrecan为软骨细胞, RUNX2为成骨细胞, CD34为间充质细胞, LUM为成纤维细胞)之间的免疫荧光共定位显示，腺病毒介导的FAM3A过表达抑制了VSMC相关的中间细胞转分化。

图5

要点5：

a.KLF4是一种新发现的平滑肌细胞重编程因子。因此，猜想FAM3A会影响KLF4信号。首先，在AAA患者和AAA小鼠模型的主动脉标本中观察到KLF4的产生显著增加。

b.在FAM3A过表达小鼠和重组FAM3A小鼠中，AAA组织中KLF4的蛋白水平均被显著抑制。

c.进一步，利用细胞核提取物探究FAM3A对KLF4核定位的调控作用。体内实验结果显示，与对照组相比，FAM3A处理组细胞核中总KLF4和磷酸化KLF4水平降低。

d-e.体外用重组FAM3A刺激VSMCs可剂量依赖性地抑制KLF4蛋白水平，沉默FAM3A可增加KLF4的产生。

f.通过共聚焦成像系统表明，FAM3A刺激显著抑制了KLF4的核定位。证实了FAM3A处理的VSMCs中SR表达较高。

图6

要点6：

a.探索FAM3A是否影响KLF4泛素化过程从而导致KLF4水平降低。用UPS抑制剂MG-132孵育VSMCs。蛋白酶体被阻断后，FAM3A引起的KLF4水平降低被消除。

b-d.此外，多聚泛素化的KLF4蛋白在FAM3A过表达或FAM3A刺激的HEK293T细胞和FAM3A刺激的VSMCs中积累，表明FAM3A可以诱导KLF4的泛素化FAM3A对KLF4的泛素化过程。蛋白质磷酸化的改变有时会影响其泛素化状态。

图7

要点7：

a.进一步研究了FAM3A诱导VSMC表型调控的机制。鉴于FAM3A已被报道可激活AKT和p-ERK1/2通路，且TGF β通路已被证明是VSMC的重要调节因子，探讨了FAM3A对体外培养VSMCs中AKT、ERK1/2和TGF β通路的影响，发现FAM3A促进了AKT，ERK1/2和SMAD3的磷酸化提高了TGF β水平。

b.在TGF β / SMAD3拮抗剂SIS3存在的情况下，FAM3A维持VSMCs收缩表型的作用被显著抑制。

c.进一步研究了TGF β是否参与了FAM3A抑制VSMCs向其他细胞类型转分化的作用。体外研究表明，TGF β阻断诱导VSMCs向巨噬细胞样、成骨样、MSC样和成纤维样VSMCs转化的趋势更强。

d.用FAM3A刺激后，磷酸化的KLF4水平显著降低，但这种抑制水平可被阻断TGF β通路显著逆转。

e-f.更重要的是，FAM3A促进KLF4泛素化和抑制KLF4核定位的作用也被TGF β阻断所抑制。

图8

要点8：

a.探索TGF β信号参与FAM3A在体内的生物学功能。结果显示，与对照组相比，AAA组织中TGF β的蛋白水平在FAM3A过表达组和重组FAM3A补充组均显著增加。

b.在TGF β / SMAD3拮抗剂SIS3或KLF4诱导剂APTO - 253存在的情况下，FAM3A维持VSMCs收缩表型的作用显著减弱。

c-d.此外，体内研究表明，在额外的TGF β / SMAD3阻断或KLF4诱导下，VSMCs有强烈的向中间型细胞转化的趋势。

e.此外，体内给予SIS3后，FAM3A抑制的ROS产生被取消。

本文小结

综上所述，研究揭示了FAM3A在AAA患者和两种小鼠AAA模型中的表达下调。过表达或补充FAM3A减弱AAA的形成。FAM3A作为VSMC命运塑造的调节因子，至少在一定程度上通过显著激活TGF β信号从而抑制KLF4的作用来维持VSMCs的良好分化状态。这些发现为进一步开发旨在恢复VSMC稳态的AAA应用策略提供了一个独特的视角。

参考文献：Lei C, Kan H, Xian X, Chen W, Xiang W, Song X, Wu J, Yang D, Zheng Y. FAM3A reshapes VSMC fate specification in abdominal aortic aneurysm by regulating KLF4 ubiquitination. Nat Commun. 2023 Sep 2;14(1):5360. doi: 10.1038/s41467-023-41177-x.