IF 37.3 Mol Cancer│LINC00922通过上调ETS1启动子的H3K27巴豆酰化引诱SIRT3促进结直肠癌的转移IF 37.3 Mol Cancer│LINC00922通过上调ETS1启动子的H3K27巴豆酰化引诱SIRT3促进结直肠癌的转移 前言
2023年10月4日，徐州医科大学病理教研室在Molecular Cancer在线发表题为“LINC00922 decoys SIRT3 to facilitate the metastasis of colorectal cancer through up-regulation the H3K27 crotonylation of ETS1 promoter”的研究论文，本研究旨在阐明组蛋白H3(H3K27cr)Lys27的巴豆酰化在促进结直肠癌转移中的作用及机制。 背景介绍 组蛋白巴豆酰化修饰是一个可逆的热力学过程，由巴豆酰转移酶和去质子酰化酶调节。SIRT3主要定位于线粒体基质中，通常被认为是一种NAD依赖性去乙酰化酶。最近，Wei等人发现用SIRT3抑制剂NAM处理细胞24小时可增加组蛋白巴豆酰化水平。此外，Bao等人证明SIRT3作为一种组蛋白去乙酰化酶，通过改变组蛋白赖氨酸克罗丁酰化来调节基因表达。他们进一步证明SIRT3识别并催化克罗丁基化组蛋白肽的水解。已有文献表明，SIRT3也定位于细胞核，通过调节核心组蛋白修饰，在生理和病理生理过程中发挥重要作用。然而，SIRT3被募集到特定基因组位点的过程尚不清楚。 图文解析
图1 要点1： A-B.利用免疫组织化学染色法对45例患者的结直肠肿瘤样本和14例患者的邻近组织中的H3K27cr水平进行了研究。有趣的是，研究结果显示远处转移部位的H3K27cr水平显著升高。 C.此外，还观察到H3K27cr水平与结直肠癌组织的分级、M分期和TNM分期之间存在相关性。值得注意的是，与癌旁组织相比，肿瘤组织中H3K27cr水平明显较高。 D.此外，III期和IV期组织中的H3K27cr水平高于I期和II期组织。考虑到远处转移与H3K27cr水平的相关性，提出H3K27cr可能促进肿瘤转移的假设。NaCr通过直接产生crotonyl-CoA提高组蛋白crotonylation水平。 E-G.为了验证这个假设，将HCT116细胞培养在添加10mM NaCr的培养基中，以提高细胞内H3K27cr的水平。结果显示，NaCr促进了CRC细胞的侵袭和迁移。这些发现提示H3K27cr促进结直肠癌转移。
图2 要点2： A.为了随后，GSEA将这些基因与上述失调的lncRNA进行比较。结果发现，这些基因在CRC组织中富集，并表现出LINC00922或其他8种lncRNA的高表达。 B.相反，LINC00922与启动子标记为H3K9cr或H3K18cr的基因之间没有显著关系。值得注意的是，过表达LINC00922显著提高了H3K27cr的水平。这些结果表明LINC00922和H3K27cr之间存在相关性。 C.随后，对TCGA队列CRC患者中LINC00922的临床意义进行了调查。结果显示，LINC00922的高表达与CRC患者较短的生存期相关。 D.接下来，检查了来自TCGA队列的LINC00922与CRC组织临床病理特征之间的相关性。Mann-Whitney U分析显示，与正常组织相比，CRC组织中LINC00922的表达显著升高。E-F.此外，在有远处或淋巴结转移的结直肠癌患者中，LINC00922的表达高于无远处或淋巴结转移的结直肠癌患者。 G.此外，GEO队列的meta分析显示，LINC00922的高表达增加了远处转移的风险。综上所述，高水平的LINC00922增加了结直肠癌转移的风险，并与结直肠癌患者预后不良相关。
图3 要点3： A-B.为了进一步探讨LINC00922与结直肠癌转移的关系，研究LINC00922在结直肠癌细胞侵袭和迁移中的作用。结果显示，LINC00922的缺失降低了CRC细胞的侵袭和迁移水平，而LINC00922的过表达则显示出相反的效果，这与伤口愈合实验的结果一致。 C.还研究了LINC00922是否在体内调节肿瘤转移。将稳定的LINC00922敲低细胞经尾静脉注入小鼠体内。结果显示，敲低LINC00922可显著减少肺转移结节。 D.在动物实验中，4只注射了sh-NC细胞的小鼠死亡。最终，从注射sh-NC细胞的4只小鼠中获得了27个转移性肿瘤结节的累积计数，平均每只小鼠产生6.75个结节。8只小鼠注射sh-LINC00922细胞，共收集到20个转移性肿瘤结节，平均每只小鼠产生2.5个结节。 E-G.免疫印迹分析显示，在敲低LINC00922后，CRC细胞中EMT相关基因(如Vimentin和Snail1)的表达水平显著下调。相反，过表达LINC00922具有相反的效果，增加了这些基因的表达水平。这些结果共同表明，LINC00922促进CRC细胞的侵袭和迁移。
图4 要点4： A-B.为了研究LINC00922是否通过H3K27cr调控结直肠癌细胞的侵袭和迁移，将LINC00922稳定敲低的细胞用10mM NaCr处理48h，恢复H3K27cr水平。结果显示，补充NaCr恢复了E-cad、Vimentin和Snail1的水平，以及稳定的LINC00922敲低细胞的侵袭和迁移，表明LINC00922通过H3K27cr调节CRC细胞的侵袭和迁移。 C.随后，使用H3K27cr抗体对过表达LINC00922的HCT116细胞进行ChIP-seq检测。在LINC00922过表达细胞和对照细胞之间，共有21253个峰表现出差异占用(|fold-change|>1.2,P<0.05)，表明LINC00922影响了H3K27cr在染色体上的占用。 D.KEGG分析上述21253个峰注释的基因的生物学途径发现转移途径的富集，包括局灶性粘附和粘附体连接。由于之前的研究表明组蛋白巴豆酰化强有力地指示了激活启动子，随后提取了653个启动子区域内有两个峰的基因进行进一步研究。 E.为了鉴定LINC00922通过H3K27cr调控的特定细胞类型，使用GSEA分析了这653个基因在结直肠癌组织单细胞转录组中的富集情况。该分析涉及来自GSE196964数据集的5678个细胞，鉴定出12个主要的细胞亚型。 F.在结肠组织中，653基因在树突状细胞、癌症相关成纤维细胞、NK细胞、巨噬细胞、祖细胞和上皮细胞中富集。在结直肠癌组织中，除了树突状细胞和转运扩增细胞外，653基因在所有细胞类型中都富集。 G-H.为了研究LINC00922通过H3K27cr影响的调控途径，注释了与这653个基因相关的生物学途径。研究结果显示，79个通路，如局灶粘附、粘附连接、紧密连接和细胞粘附分子(CAMs)，包含超过5个基因。在包含CRC和LM组织的GSE225857数据集中，对20,753个细胞进行了全面分析，鉴定出12种主要细胞亚型。将这79条通路分别与CRC和LM组织中提取的上皮细胞进行比较。结果发现，CAMs通路在LM组织来源的上皮细胞中呈负富集，而在CRC组织来源的上皮细胞中不呈负富集。这些研究结果表明，LINC00922通过h3k27cr介导的CAMs在结直肠癌上皮细胞中的表达促进了侵袭和迁移。
图5 要点5： A-B.本研究证明外源性ETS1也促进了CRC细胞的侵袭、迁移和细胞运动。 C.此外，过表达ETS1增加了Vimentin和Snail1的表达，降低了E-cad的表达。 D-F.通过恢复Vimentin和Snail1的水平，抑制ETS1可以恢复CRC细胞的侵袭、迁移和细胞运动水平。这些结果表明LINC00922通过ETS1调节侵袭和迁移。
图6 要点6： A.研究LINC00922是否改变了ETS1的表达。对28例CRC患者的组织进行了qRT-PCR分析。结果显示，LINC00922的表达与ETS1有直接的相关性。 B-C.敲低LINC00922的表达表明，瞬时和稳定敲低LINC00922都降低了ETS1 mRNA的水平。 D.相反，CRC细胞中LINC00922的过表达增加了ETS1的mRNA水平。 E-G.此外，ETS1的蛋白水平也表现出类似的趋势。H.荧光图像还显示，稳定的LINC00922敲低显著降低了ETS1的蛋白水平。 I.研究LINC00922是否通过H3K27cr调控ETS1的表达。首先，10mM NaCr处理的HCT116细胞增加了H3K27cr和ETS1的水平，表明H3K27cr可能激活ETS1转录。然后在稳定的LINC00922敲低细胞培养基中加入10mM NaCr，孵育48h恢复H3K27cr水平。 K.研究发现，NaCr恢复了LINC00922稳定敲低细胞的ETS1表达，表明LINC00922通过调节H3K27cr调节ETS1表达。对LINC00922在细胞核和细胞质之间分布的分析显示，大多数LINC00922 RNA集中在细胞核内。 L-M.ChIP-seq数据显示，LINC00922过表达增加了H3K27cr对ETS1启动子区域的占据。ChIP-qPCR也证实了这一结果，说明沉默LINC00922显著降低了H3K27cr对ETS1启动子区域的占据，而外源LINC00922则起到相反的作用。研究结果表明LINC00922改变了ETS1启动子上H3K27cr的富集水平，导致ETS1表达的变化。
图7 要点7： A.研究了LINC00922如何改变ETS1启动子上H3K27cr的富集水平。HCT116细胞的ChIP-seq显示SIRT3分布在TSS区附近。然而，SIRT3如何向TSS区富集的过程尚不清楚。假设LINC00922参与了SIRT3向TSS区域的富集。为了验证这一点，首先研究了HCT116细胞中SIRT3和H3K27cr之间的相关性。 B-C.免疫荧光图像显示，SIRT3和H3K27cr在HCT116细胞的细胞核中共定位。不出所料，外源性SIRT3降低了H3K27cr水平。接下来，研究了LINC00922是否通过调节SIRT3改变了H3K27cr的占据。 D.RNA免疫沉淀(RIP)实验显示，LINC00922在HCT116细胞中与SIRT3相互作用，并且在过表达SIRT3的HCT116细胞中富集程度要高得多。E.荧光原位杂交(RNA-FISH)显示，在HCT116细胞中，LINC00922与SIRT3共定位。F.RIP实验还显示，在HCT116细胞中，LINC00922与H3K27cr相互作用。 G.利用ChIP-qPCR研究了LINC00922是否影响了ETS1启动子区域SIRT3的富集。结果显示，在LINC00922敲低的细胞中，ETS1启动子区域SIRT3的富集程度更高，而外源LINC00922则表现出相反的效果。 H.通过将SIRT3和LINC00922质粒共转染HCT116细胞48小时，进行恢复实验以恢复H3K27cr水平。值得注意的是，SIRT3过表达恢复了ETS1的表达。研究结果表明LINC00922与SIRT3相互作用并将其逐出ETS1启动子区域，从而增加了ETS1启动子区域的H3K27cr水平，激活了ETS1表达。 本文小结 综上所述，该发现揭示了由LINC00922调控的H3K27cr在促进结直肠癌转移中的一种新的调节功能。这一发现有助于更深入地理解组蛋白巴豆酰化在结直肠癌转移过程中的作用。 参考文献： Liao, M., Sun, X., Zheng, W. et al. LINC00922 decoys SIRT3 to facilitate the metastasis of colorectal cancer through up-regulation the H3K27 crotonylation of ETS1 promoter. Mol Cancer 22, 163 (2023). https://doi.org/10.1186/s12943-023-01859-y |
