IF=16.6 Nature Communications│通过线粒体生物发生促进的线粒体转移有效干预肺纤维化IF=16.6 Nature Communications│通过线粒体生物发生促进的线粒体转移有效干预肺纤维化
前言 2023年9月18日，浙江大学药学院及肿瘤中心的高建清教授联合张添源研究员团队在Nature Communications上发表了题为“Efficient intervention for pulmonary fibrosis via mitochondrial transfer promoted by mitochondrial biogenesis”的研究论文，本研究为克服目前线粒体补充治疗的局限性提供了一种潜在的策略，从而促进纤维化干预的治疗应用。 背景介绍 线粒体是控制真核细胞稳态、生物能量、新陈代谢、生物合成和细胞凋亡的细胞器。最近的研究揭示了线粒体作为信号细胞器的其他功能，参与细胞应激感知、细胞动力学、蛋白质分泌和细胞衰老。线粒体在功能细胞中的这些关键作用使得线粒体功能障碍成为一种相当重要的发病机制。先前的一些研究表明，肺细胞中线粒体的功能障碍是促进肺纤维化(PF)的主要原因之一。对线粒体功能障碍细胞具有高度特异性的高效线粒体递送是线粒体补充治疗（MRT）成功的关键。本研究旨在确定在低能量需求的MSCs中促进线粒体生物发生的可能性，以及这些线粒体增加的MSCs在治疗进行性PF中的治疗益处。 图文解析
图1 要点1： 研究人员观察到，用治疗糖尿病的处方药吡格列酮(Pg)谨慎地处理人胎盘来源的MSC(hMSC)，可以有效地激活hMSC中的线粒体生物发生，主要是通过PGC-1α-NRF1-TFAM途径。此外，利用Pg处理和氧化铁纳米颗粒(IONPs)刺激的联合工程(Pg-Fe-hMSC)可以实现工程化hMSC高效、持续的细胞间线粒体递送，研究人员称之为高功率hMSC。因此，在进行性PF的小鼠模型中，这些高功率的hMSCs显示出显著的干预PF进展的治疗能力。此外，在纤维化的人肺细胞和三维(3D)人源化肺球体中都证实了高功率hMSCs的有效治疗潜力。
图2 要点2： a.由于PGC-1α被认为是线粒体生物发生的主导调节因子，接下来研究了Pg对PGC-1α表达水平的生物效应。正如预期的那样，Pg处理显著提高了hMSC和Fe-hMSC中PGC-1α的表达。 b-c.为了充分了解Pg诱导线粒体生物合成增强的机制，评估了PGC-1α途径中的两个下游因子，包括核呼吸因子1(NRF1)和线粒体转录因子A(TFAM)，它们驱动mtDNA的产生并增加线粒体质量。如图所示，NRF1和TFAM的基因表达均显著上调。因此，上述结果证实，在最佳条件下Pg处理可激活PGC-1α/NRF1/TFAM信号，从而诱导hMSC线粒体生物合成。 d.联合应用Pg和IONPs处理同时增加线粒体质量和hMSC间隙连接(Pg-Fe-hMSC)，获得了最高的线粒体转移率(30%)，几乎是原始hMSC的两倍，显著高于研究人员之前报道的Fe-hMSC。此外，Pg处理不影响hMSC的这一重要特性，即对损伤的TC-1细胞具有较高的线粒体转移率，而对健康的TC-1细胞具有较低的转移率。 e.抑制Pg-hMSC的PGC-1α表达(siPGC-Pg-hMSC)后，线粒体信号和线粒体转移率均降低。 f-g.通过定量分析进一步证实了线粒体质量与线粒体转移率之间的相关性。 h-k.有趣的是，使用PGC-1α编码质粒的基因工程hMSC显示出与Pg处理类似的PGC-1α、NRF1和TFAM的上调，并显著促进PGC-1α转染的hMSC(PGC-hMSC)的线粒体转移能力。因此，研究人员认为Pg通过PGC-1α/NRF1/TFAM信号通路诱导线粒体生物合成可能是有效增强hMSC线粒体转移能力的潜在策略。 l-o.如图所示，Pg-Fe-hMSC不仅实现了最高的线粒体转移率，而且在至少96 h内保持了高效的线粒体转移能力。
图3 要点3： a-c.与Pg-hMSC和Fe-hMSC相比，Pg-Fe-hMSC在恢复BLM-TC-1细胞内ATP水平、降低活性氧(ROS)水平和恢复受损的线粒体膜电位(MMP)方面表现出最佳的治疗潜力。 d.正如预期的那样，Pg-Fe-hMSC也表现出最好的保护BLM-TC-1细胞免受BLM处理引起的严重死亡的能力。 e-g.研究人员的结果表明，当抑制PGC-1α表达时，Pg-hMSC恢复BLM-TC-1细胞中ATP水平、降低ROS水平和恢复受损的MMP的治疗潜力受到负面影响。 h.此外，Pg-hMSC预防BLM处理后TC-1细胞凋亡的保护作用也受到不利影响。 i-l.同时，通过基因转染上调hMSC中PGC-1α的表达，在恢复BLM-TC-1细胞线粒体稳态和保护TC-1细胞免受BLM处理造成的损伤方面也表现出类似的效果。 m.因此，利用Pg处理改善PGC-1α依赖的线粒体生物发生的工程被认为对增强Pg-hMSC挽救BLM-TC-1细胞的治疗潜力具有积极作用。
图4 要点4： a.micro-CT观察显示，Pg-Fe-hMSC治疗后肺部纤维化进展明显减轻，而hMSC、Pg-hMSC和Fe-hMSC治疗后仍保留纤维化的CT特征。 b.肺组织切片的HE染色和Masson三色染色进一步证实了Pg-Fe-hMSC的最佳治疗潜力，显著减少了纤维化面积。此外，Masson三色染色的定量分析进一步验证了Pg-Fe-hMSC显著缓解的纤维化比例。 c.此外，每个处理组中的3个独立的肺样本被均质化以确定胶原表达水平，显示Pg-Fe-hMSC显著减少了胶原沉积。 d-e.10个独立肺样本的支气管肺泡灌洗液(BALF)测定进一步显示，Pg-Fe-hMSC治疗后MMP9和转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平显著降低。f.同样，8个肺组织匀浆样本的羟脯氨酸测定证实了Pg-Fe-hMSC的最佳治疗效率，比Fe-hMSC或Pg-hMSC更有效。g.如图所示，与健康线粒体(以绿色表示)的形态相比，纤维化肺细胞中受损的线粒体(以棕色表示)显示出肿胀的嵴结构和破裂的膜。 h-i.此外，线粒体的面积和周长如前所述，进一步支持了Pg-Fe-hMSC在纤维化肺细胞中恢复线粒体形态的最佳治疗潜力。 j.综上所述，基于上述参数的形态学评价证实了Pg-Fe-hMSC在降低异常线粒体比例方面的显著治疗效果。 k.有趣的是，肺组织切片的病理学观察显示，两次Pg-Fe-hMSC治疗与连续21天每天服用吡非尼酮的治疗效果相当。 l-o.此外，纤维化比例的定量计算以及MMP9、TGF-β和羟脯氨酸水平的测定证实了与吡非尼酮相比的治疗效果。同时，初步的安全性评价显示，Pg-Fe-hMSC治疗小鼠引起的副作用可以忽略不计。
图5 要点5： a.EpCAM抗体免疫荧光染色证实从肺组织中成功分离出hLEC。b.考察了不同工程化hMSC向损伤hLEC的细胞间线粒体转移，发现Pg-Fe-hMSC的线粒体转移率最高。 c-e.因此，研究人员观察到Pg-Fe-hMSC有效地减少了ROS的产生和TGF-β的分泌，并有效地保护了hLEC免受BLM诱导的损伤；同时，使用Pg-hMSC或Fe-hMSC的处理表现出与hMSC类似的有限保护作用。 f.根据先前的报道，建立了一个包含人支气管上皮细胞(BEAS-2B)和人正常肺成纤维细胞(Hs888lu)的3D多细胞人球形体模型，作为可靠的人PF模型。g.如图所示，BLM处理诱导纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)和I型胶原(collagen-I)表达增加，表明成功诱导PF进展。 h.将不同的工程化hMSCs添加到诱导纤维化后的3D多细胞人肺球体模型中。观察到Pg-Fe-hMSC在局部给药后迁移到球体内部，并实现了最高的细胞间线粒体转移，其效率>30%，远高于研究人员之前的Fe-hMSC。 i-k.由于高效的线粒体转移能力，Pg-Fe-hMSC显著降低了TGF-β的分泌，减少了ROS的积累，降低了细胞的死亡率。总的来说，Pg-Fe-hMSC显示出显著高的细胞间线粒体转移能力，这可能用于抵抗单细胞的和多细胞人源化纤维化模型中的纤维化。
图6 要点6： a.Pg-Fe-hMSC给药后肺组织中mtDNA含量最高。 b.与Fe-hMSC相比，Pg-Fe-hMSC(fold change > 1.2,P < 0.05)处理后小鼠肺中有51个基因表达上调。c.GO分析进一步表明，上调基因富集在线粒体组织、线粒体自噬、电子传递链和ATP生物合成过程。d.此外，使用STRING数据库(https://string-db.org/),)分析了Pg-Fe-hMSC治疗后小鼠肺中上调基因的相互作用网络，其中包括MT-CO1，MT-CO2，MT-ND1，MT-ND3，TOMM5和TOMM6等6个关键基因的变化。 e-h.肺纤维化细胞中这些基因的表达量最低，说明BLM处理干扰了氧化磷酸化和ATP的生物合成。然而，Pg-Fe-hMSC处理显著提高了这些基因的表达，而Fe-hMSC则无法达到类似的效果。 i-j.同样，只有Pg-Fe-hMSC处理显著恢复了纤维化肺细胞TOMM5和TOMM6的基因表达谱。总之，上述结果表明，外源线粒体高效转移至纤维化肺细胞，不仅补充了受损的线粒体，而且逆转了被抑制的线粒体自噬，这可能进一步有助于线粒体稳态的恢复，从而阻止纤维化进展。 全文小结 总之，本研究显示了MRT在小鼠和人细胞模型中治疗PF进展的潜在治疗潜力。此外，通过增强线粒体生物合成和增加线粒体转移能力的MSCs的工程，可能为克服特异性靶向损伤细胞的高效和持续线粒体转移的重大挑战提供潜在的解决方案，从而促进MRT在治疗线粒体功能障碍引起的各种疾病中的实际应用。 参考文献：Huang, T., Lin, R., Su, Y. et al. Efficient intervention for pulmonary fibrosis via mitochondrial transfer promoted by mitochondrial biogenesis. Nat Commun 14, 5781 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41529-7 |
