IF 9.2 npj Biofilms and Microbiomes│肠道阿米巴对生物膜的消化外胞吞噬作用及其对应激耐受性和细胞毒性的影响

IF 9.2 npj Biofilms and Microbiomes│肠道阿米巴对生物膜的消化外胞吞噬作用及其对应激耐受性和细胞毒性的影响

前言

2023年10月9日，以色列海法的技术翁大学罗斯和布鲁斯·拉帕波特医学学院分子微生物学系等多个实验室联合在《npj Biofilms and Microbiomes》发表研究论文“Digestive exophagy of biofilms by intestinal amoeba and its impact on stress tolerance and cytotoxicity”。研究发现，生物被膜-原核生物之间的相互作用与寄生虫和浮游细胞之间的相互作用有着本质的不同。溶组织芽孢杆菌半胱氨酸蛋白酶(CPs)在生物膜降解中的作用具有很好的保守性，可以在肠道致病菌E . coli、S . Typhimurium和E . faecalis的生物膜中证明。

背景介绍

人类原生动物寄生虫溶组织内阿米巴是阿米巴病的罪魁祸首，阿米巴病是发展中国家的一种地方病。溶组织芽胞杆菌滋养体在大肠中定植，主要以细菌为食。然而，在胃肠道中，细菌细胞形成聚集体或结构群落，称为生物膜，太大而无法吞噬。值得注意的是，滋养体仍然能够入侵和降解已建立的生物膜，利用一种模仿消化自噬的机制。消化性自噬是指消化酶的分泌，促进吞噬细胞对体积过大而不能直接吞噬的物体的消化。CPs在枯草芽孢杆菌生物膜降解过程中起着至关重要的作用。这些蛋白酶针对枯草芽孢杆菌生物膜基质的主要成分TasA，也有助于寄生虫对生物膜的粘附。此外，它们还参与革兰氏阴性和革兰氏阳性肠道病原体形成的生物膜的降解。此外，生物膜在保护滋养体免受氧化应激方面也起着重要作用。这种特殊的机制表明，变形虫已经适应了捕食生物膜，潜在地作为一个未开发的水库，为新的治疗方法治疗生物膜。从变形虫中提取的产品一直被证明可以恢复生物膜细胞对抗生素的敏感性。

图文解析

图1

要点1：

A.为了研究溶组织内阿米巴滋养体与B . subtilis生物被膜的相互作用，研究人员检测了滋养体与生物被膜的结合随时间的变化。将GFP标记的滋养体与

B.subtilis生物膜共孵育。通过测量GFP的水平，可以知道与生物被膜表面结合的滋养体的数量。观察发现，与生物被膜结合的滋养体数量逐渐增加，最终在30 min后达到平台期。B.滋养体与生物膜的相互作用导致了时间和剂量依赖性的生物膜降解。在孵育3小时后，生物膜降解了55%，在与106个滋养体孵育6小时后，这一降解显著增加至79%。

C.与105和5×105个滋养体一起孵育3小时分别导致生物膜降解了28%和47%，更高的滋养体浓度导致了55%的降解率增加。

图2

要点2：

A.共聚焦显微镜显示在滋养体附近形成了生物膜清除区域。

B.在生物膜内观察到滋养体位于不同的层次，表明它们在整个生物膜结构中进行了穿透和定植。

C.观察到了吞噬作用的证据，TasA表达细胞在整个生物膜内的滋养体中被发现。

D-E.扫描电子显微镜提供了滋养体牢固附着在生物膜表面的视觉证据。

图3

要点3：

A.转录组谱之间的这种区别突出显示了滞留生物膜与游离细胞相互作用的滞留体之间的显著差异。

B.为了评估阿米巴组织内寄生物在区分枯草杆菌生物膜细胞和游离细胞方面的区分能力，进行了基因表达的广泛分析。根据其编码的蛋白质类别，利用生物信息学工具PANTHER对WT+ bB（野生型加生物膜）和WT+ pB（野生型加游离）之间的差异调控基因进行了分类。PANTHER统计过表达测试31显示，在与B. subtilis生物膜接触的寄生虫中，编码小GTP酶（PC00208）的基因（如AIG1家族蛋白（EHI_15250））和半胱氨酸蛋白酶（CPs）（PC00081）的基因（如CP（EHI_151440））显著富集。寄生虫中特定CPs表达的上调强烈暗示了它们在生物膜降解中的重要作用。相反，与WT+ pB相比，WT+ bB中下调基因的功能分类类别显示在图中。C.在E. histolytica滋养体暴露于B. subtilis生物膜时，发现CPs基因（如EHI_151440、EHI_200690、EHI_117650和EHI_126170）上调表达。

D-I.在所有条件下，相同数量的滋养体与生物膜一起培养。经过E64D处理的滋养体附着、穿透和降解B. subtilis生物膜的能力严重受损，显示了CP在生物膜降解中的重要作用。其中最重要的CP之一是EhCP5（EHI_168240），它是一种存在于寄生虫表面并被分泌出来的主要致病因子。EhCP5在暴露于B. subtilis生物膜的滋养体中并没有显示出增加的表达。然而，它在寄生虫表面的定位和分泌表明它可能参与生物膜降解的初始阶段。为了验证这个假设，利用RNA干扰基因沉默35来降低EhCP5的表达。与野生型寄生虫相比，EhCP5沉默的滋养体显示出明显降低的CP活性（活性减少60%）和降解B. subtilis生物膜的能力（降解减少70%）。这些发现为E. histolytica CPs，特别是EhCP5，在B. subtilis生物膜降解中的作用提供了强有力的证据。

图4

要点4：

A.根据其对基质的靶向作用，使用滋养体提取物处理预先建立的生物膜明显增强了生物膜细胞对NaOCl的响应。此外，在抑制滋养体提取物中的CPs活性后观察到该协同效应的部分逆转。

B.通过对tasA突变体生物膜进行处理和未处理两种方式评估其对NaOCl的敏感性。在各种处理条件下，观察到突变体生物膜对NaOCl暴露的响应没有明显差异。这一发现强调了TasA在促进对NaOCl的抗菌抵抗力方面的重要性。删除主调控因子SinI会抑制外多糖和TasA的形成，相比TasA突变体，这导致对NaOCl的敏感性略微增加。这表明TasA突变体中残留的外多糖在一定程度上为生物膜细胞提供了一定的抵抗力。与未经处理的单个突变体相比，当突变体与提取物结合时没有观察到额外的效果。

C.E. histolytica的CPs对高剂量氨苄青霉素敏感性的显著增加贡献了80%的最小生物膜抑制浓度（MBIC）。

D.相比之下，tasA突变体生物膜对氨苄青霉素表现出了增加的敏感性。当暴露于提取物时，这种敏感性并没有减少，突显了细胞外基质在抗生素抗性中的重要性。在枯草杆菌中，氨苄青霉素的抗性是通过激活由替代胞外细胞质sigma因子SigW40,41调节的细胞壁应激响应来实现的。一致的是，sigW突变体对氨苄青霉素表现出了增加的敏感性，但它对提取物也有明显的反应。

图5

要点5：

A.此外，枯草杆菌的游离形式并不影响阿米巴原虫对枯草杆菌生物膜的降解，而超声处理的生物膜则表现出强效的抑制寄生虫结合的作用。这些发现表明，寄生虫是与生物膜中的特定组分结合。为了确定TasA是否直接参与阿米巴原虫与生物膜的结合，纯化的TasA（0.01％）被用作竞争物质，而明胶（1％）作为TasA的蛋白质对照。明胶并不影响阿米巴原虫对生物膜的降解，表明它不与寄生虫竞争或参与结合过程。然而，纯化的TasA显著降低了寄生虫附着于生物膜的能力，强烈暗示TasA参与了埃希氏阿米巴和生物膜之间的结合。B.依赖CP的TasA降解，但纯化的TasA并不影响寄生虫对CP的分泌。

图6

要点6：A.在暴露于生物膜的滋养体中，与埃希氏阿米巴对氧化应激（OS）的反应有关的几个基因被下调，例如硫氧还蛋白还原酶（EHI_155440）47、EhNO1（EHI_110520）（EhNO1主要参与铁的还原）48、DNA损伤识别基因如切除修复蛋白RAD23（EHI_001400）49以及许多脱氢酶的水平。B-C.在存在H2O2（2.5 mM）的情况下，与在暴露于H2O2之前与游离态和生物膜态的枯草芽孢杆菌培养的滋养体相比，对照组滋养体的氧化应激物（OXs）水平显著增加。此外，与对照组滋养体和与游离态培养的滋养体相比，与枯草芽孢杆菌生物膜态培养的滋养体显示出显著降低的OXs水平，从而表明生物膜对H2O2诱导的氧化应激具有保护作用。D-E.位于生物膜顶部的E. histolytica滋养体与穿透到较低层的滋养体相比，ROS水平较高。根据观察结果，在生物膜的同一层次上，一些寄生虫显示出强烈的ROS信号，而其他寄生虫则没有，可以推断H2DCFDA试剂能够深入渗透到生物膜的较低层。

图7

要点7：

A.EhCPs能够降解枯草杆菌（B. subtilis）生物膜，并且E. coli和B. subtilis生物膜均具有蛋白质的性质，这促使测试EhCPs是否能够降解E. coli生物膜。的数据表明，E. histolytica滋养体能够降解E. coli生物膜。相反，经过E64D处理的滋养体无法降解E. coli生物膜。

B.寄生虫对大肠杆菌生物膜的捕食在生物膜细胞而不是游离生物体的存在下受到抑制，表明寄生虫对生物膜的特异性识别。与枯草杆菌不同，黏附涉及到细菌的碳水化合物组分，因为它受到糖蛋白阿西阿佛蛋白和基质淀粉样蛋白CsgA对CPs的抑制。

C-H.通过比较处理后剩余附着生物量的结晶紫染色法，以及生物膜/游离细胞计数，与和其他人之前的研究相一致，来评估生物膜降解情况。这些结果清楚地表明，大肠杆菌生物膜中的CPs依赖性降解不是由于总体生长的减少，而是由于游离细胞（游离生活）和附着细胞（生物膜）之间比例的改变。为了扩大的研究，还探索了阿米巴组织吞噬虫破坏其他肠道细菌形成的生物膜的能力。值得注意的是，滴虫裂解液能够显著促进沙门氏菌和肠球菌生物膜的降解。这些结果表明，CPs介导了更广泛的肠道病原体生物膜溶解。由于观察到的效应特异地针对生物膜的生物量。

图8

要点8：

CPs介导了更广泛的肠道病原体生物膜溶解。由于观察到的效果是针对生物膜生物量的，研究人员推测这可能归因于对构成微生物基质的各种粘附素的广谱影响。

本文小结

综上所述，研究结果表明，溶组织芽孢杆菌滋养体可以利用生物膜作为屏障，降低寄生虫的OS，同时从根本上改变剩余生物膜细胞的应激/抗生素耐受性，这突出了生物膜-变形虫相互作用是微生物界应激耐受性和致病性的一个意想不到的重要调节因子。

参考文献：Zanditenas E, Trebicz-Geffen M, Kolli D, Domínguez-García L, Farhi E, Linde L, Romero D, Chapman M, Kolodkin-Gal I, Ankri S. Digestive exophagy of biofilms by intestinal amoeba and its impact on stress tolerance and cytotoxicity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2023 Oct 9;9(1):77. doi: 10.1038/s41522-023-00444-x. PMID: 37813896;

https://www.nature.com/articles/s41522-023-00444-x