IF 16.6 Nature Communications│胞浆内核酸酶G通过mTORC2-AKT-ACLY和内质网应激促进非酒精性脂肪性肝病

IF 16.6 Nature Communications│胞浆内核酸酶G通过mTORC2-AKT-ACLY和内质网应激促进非酒精性脂肪性肝病

前言

2023年10月4日，新加坡国立大学癌症和干细胞生物学唐洪文联合暨南大学附属第六医院的周庆华和王文军在《Nature Communications》上发表了题为“Cytoplasmic Endonuclease G promotes nonalcoholic fatty liver disease via mTORC2-AKT-ACLY and endoplasmic reticulum stress”的文章。该研究证明了核酸内切酶G(ENDOG)的缺失抑制了乙酰辅酶a的产生和脂质合成，同时减少了内质网应激，最终缓解了雌性小鼠高脂肪饮食诱导的非酒精性脂肪肝疾病。

背景介绍

最近的研究表明，ENDOG与多种人类疾病有关。ENDOG是帕金森病中α-突触核蛋白细胞毒性的关键下游执行者。在HBV相关的肝细胞癌中，ENDOG的核易位导致肝细胞基因组不稳定并促进肝细胞癌的发展。ENDOG参与心肌肥大和线粒体肌病。ENDOG基因敲除小鼠中，ENDOG基因的缺失促进了产热基因的表达和白色脂肪组织的褐变，以及更好的葡萄糖耐量和脂肪量。然而，ENDOG是否调节肝脏脂质代谢和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)仍不清楚。

图文解析

图1

要点1：

a-c.为了证实ENDOG与脂质代谢之间的关联，检测了ENDOG基因敲除小鼠和肝细胞中的脂滴。研究人员发现，与同窝对照小鼠(ENDOG+/-)的肝脏相比，ENDOG基因敲除小鼠(ENDOG-/-)的肝脏中脂滴的数量减少了，但大小没有减少。

d.ENDOG基因敲除小鼠肝脏中总甘油三酯水平显著降低。

e-f.BODIPY染色也显示ENDOG的缺失减少了小鼠肝脏中的脂质区域。

J-i.在肝细胞系中，研究人员还发现在正常条件下敲除ENDOG可减少脂质积累。ENDOG耗竭显著抑制油酸处理诱导的脂质积累和甘油三酯产生。此外，还发现在正常或油酸处理条件下，ENDOG的缺失或敲低显著降低了PLIN2(脂滴标记物)的表达。相反，在油酸或对照处理下，ENDOG的过表达促进了脂质积累和甘油三酯的产生。

图2

要点2：

a-b.为了确定ENDOG介导的脂质积累的潜在途径，研究人员对野生型和ENDOG过表达细胞进行了RNA-Seq转录组分析。ENDOG确实促进了AKT在Ser473和Thr308位点的磷酸化，以及它的下游靶点ACLY。相反，敲除ENDOG抑制AKT和ACLY的磷酸化。

c-d.研究人员假设ENDOG敲除细胞中脂质合成的抑制可能是由于乙酰辅酶a的缺乏。实验结果发现在ENDOG敲除细胞和小鼠肝脏中检测到乙酰辅酶a水平显著降低。然而，过表达ENDOG会增加肝细胞中的乙酰辅酶a。

e-g.柠檬酸盐为脂质生物合成提供乙酰辅酶a，并通过激活脂肪酸合成的第一酶ACC26来促进脂质合成。研究人员发现额外补充柠檬酸盐增加了野生型细胞中的脂质积累，但不能恢复ENDOG敲除细胞中的脂滴积累和甘油三酯浓度。

h-j.然而，补充乙酰辅酶a恢复了ENDOG敲除细胞中降低的甘油三酯含量和脂滴积累。综上所述，这些数据表明ENDOG通过激活AKT/acly介导的乙酰辅酶a生成来促进脂质合成。

图3

要点3：

a-b.为了研究ENDOG是否在高脂饮食模型中调节肝脏脂质积累，将ENDOG全身和肝脏特异性敲除的雄性和雌性小鼠喂养16周高脂饮食。观察到，与对照组相比，ENDOG基因敲除雌鼠在高脂饮食喂养过程中体重增长缓慢。

c-d.解剖结果显示，与同窝对照小鼠相比，ENDOG基因敲除小鼠的eWAT、iWAT、BAT的重量和大小以及肝脏重量均有所减少。

e-f.肝切片H&E染色显示，ENDOG基因敲除能改善HFD诱导的肝脂肪变性。

g-h.饲喂HFD后，ENDOG基因敲除的雌性小鼠肝脏中总甘油三酯和血清中游离脂肪酸也减少。

i-k.为了验证ENDOG缺失是否抑制了肝脏脂质积累，研究人员制造了肝脏特异性敲除小鼠(ENDOGLKO)和对照小鼠(ENDOGflox)，然后给它们喂食HFD。ENDOG的肝脏特异性缺失抑制了雌性小鼠的体重、白色脂肪组织和肝脏重量，但不影响NFBG和棕色脂肪组织重量。1-m.与ENDOGLKO小鼠肝脏相比，HFD诱导的肝脏脂肪变性在ENDOGflox小鼠肝脏中也得到了缓解。n-o.ENDOGLKO小鼠肝脏中的总甘油三酯和血清中的游离脂肪酸也降低了。

p-s.与ENDOG敲除细胞结果一致，在HFD条件下检测到全身和肝脏特异性ENDOG敲除雌性小鼠肝脏中AKT和ACLY的磷酸化降低。

图4

要点4：

a-b.研究人员发现ENDOG的过表达抑制了14-3-3γ和Rictor之间的相互作用。

c.内源性Co-IP结果显示，ENDOG的缺失增强了14-3-3γ与Rictor的结合。

d-e.通过亚细胞组分分离，观察到油酸处理促进ENDOG从线粒体释放到细胞质。

f.Tim23(一种线粒体内膜蛋白,指示线粒体)和ENDOG染色结果显示，油酸处理促进了ENDOG的细胞质转位。

g.重要的是，油酸处理增强了ENDOG与14-3-3γ的结合，减弱了14-3-3γ与Rictor的相互作用。

h-i.这些数据表明ENDOG与14-3-3γ释放的Rictor竞争性结合，最终激活mTORC2信号通路。接下来，研究人员研究了14-3-3γ是否可以影响ENDOG介导的AKT-ACLY激活和脂质积累。结果显示，14-3-3γ过表达抑制了ENDOG介导的AKT-ACLY的激活、脂质积累和总甘油三酯水平。这些数据表明，ENDOG在油酸处理下被释放到细胞质中，然后与14-3-3γ竞争性结合释放Rictor，最终激活mTORC2-AKT-ACLY轴并导致脂质积累。

图5

要点5：

a.为了清楚ENDOG是否调节脂质代谢，包括脂质合成、摄取、氧化和输出。敲低ENDOG抑制脂质合成相关基因ACC1、ACC2和FAS的转录，但不影响脂质摄取、氧化和输出相关基因的转录。

b-c.此外，敲除ENDOG抑制了FAS和ACC的蛋白水平，而过表达ENDOG则促进了它们的表达。

d.通过对RNA-seq数据进行GO-CC分析，发现ER相关基因集，包括内质网膜管腔侧(NES = -1.86,p值=0.000)、内质网蛋白复合体(NES = -1.45,p值=0.000)和线粒体相关的内质网膜(NES = -1.62,p值=0.017)在油酸处理的ENDOG过表达细胞中下调，表明ENDOG可能调节ER功能。

e.研究人员发现ENDOG的缺失抑制了两个内质网应激传感器IRE1a和PERK的表达。用内质网应激诱导剂(衣霉素和毒胡萝卜素)处理激活野生型细胞中的内质网应激。然而，ENDOG敲除细胞中的内质网应激明显被阻断。

f-g.此外，当用毒胡萝卜素处理细胞时，ENDOG耗竭抑制了内质网应激诱导的脂滴积累和甘油三酯合成。

h-i.ENDOG缺失抑制了HFD小鼠肝脏中ER应激传感器和UPR信号的表达。

j-l.ENDOG敲除抑制了内质网应激传感器和SREBP1在衣霉素注射后的表达。同样，衣霉素处理后，肝脏特异性ENDOG基因敲除小鼠肝脏中FAS、ACC和甘油三酯的表达水平降低。

图6

要点6：

a.通过重新分析ENDOG IP-Mass数据，发现ENDOG与一些分子伴侣蛋白和内质网驻留蛋白或线粒体相关的内质网膜(MAM)蛋白相互作用，包括Bip，Grp75和钙黏合素。

b.Co-IP结果证实ENDOG与Bip和Grp75结合。

c.通过对ENDOG和Grp75的共染，观察到它们在正常条件下的共定位，而在油酸或内质网应激诱导剂处理后，它们的共定位增强。

d-e.发现油酸处理增加了ENDOG与ER驻留蛋白的共定位，包括钙黏合素和Bip。

f-g.与之一致的是，使用原位PLA(邻位连接分析(proximal ligation assay))，也观察到ENDOG与Bip的内源性相互作用，油酸处理增加了ENDOG与Bip的相互作用。

h.在ER组分中检测到了成熟的ENDOG，并且油酸增加了ER局部ENDOG的水平。

i.与之一致的是，通过使用ER富集试剂盒(ER-036,Invent Biotechnologies)发现油酸在ER富集中促进ENDOG水平。

k.在没有ENDOG的情况下，Bip与PERK和IRE1a的相互作用增强。

l.此外，在油酸处理条件下，ENDOG与Bip的结合增加，而Bip与IRE1a/PERK的结合减少。

图7

要点7：

a.通过共染ENDOG和线粒体基质蛋白HSP60，发现VDAC抑制剂VBIT-12预处理抑制了ENDOG从线粒体中的释放。

b-g.亚细胞组分分离也表明VBIT-12降低了油酸诱导的ENDOG释放。此外，VBIT-12预处理抑制了油酸诱导的内质网应激、FAS和ACC的表达以及AKT-ACLY的激活。与此一致，VBIT-12部分降低了油酸诱导的脂质积累。这些数据表明，抑制ENDOG从线粒体中的释放可以通过阻断AKT-ACLY的激活和FAS/ACC的表达来减少脂质积累。

h.总之，研究揭示了在高脂饮食或ER应激诱导剂处理下，ENDOG从线粒体中释放。细胞质中的ENDOG与14-3-3γ竞争性结合，使Rictor解离，激活mTORC2-AKT-ACLY轴，导致乙酰辅酶A的产生。此外，ENDOG转运至内质网并与Bip相互作用，释放IRE1α和PERK，随后激活ER应激。激活的内质网应激促进SREBP1的表达和成熟以及FAS和ACC的转录。ENDOG敲除减少乙酰辅酶A生成、脂质合成和内质网应激，最终缓解HFD诱导的NAFLD。

全文小结

综上所述，研究数据表明，一方面，ENDOG缺失通过mTORC2-AKT-ACLY轴减少脂质合成底物乙酰辅酶A；另一方面，ENDOG的缺失通过转位到内质网并随后激活内质网应激来抑制脂质合成酶的表达。ENDOG敲除小鼠肝脏中减少的脂质积累和内质网应激最终缓解了HFD诱导的雌性NAFLD。

参考文献：Wang, W., Tan, J., Liu, X. et al. Cytoplasmic Endonuclease G promotes nonalcoholic fatty liver disease via mTORC2-AKT-ACLY and endoplasmic reticulum stress. Nat Commun 14, 6201 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41757-x