IF 16.6 Nature Communications│真核新生RNA结构的全基因组探测阐明了共转录折叠及其抗诱变作用IF 16.6 Nature Communications│真核新生RNA结构的全基因组探测阐明了共转录折叠及其抗诱变作用
前言 2023年9月20日，中山医学院杨建荣教授团队在Nature Communications发表题为“Genome-wide probing of eukaryotic nascent RNA structure elucidates cotranscriptional folding and its antimutagenic effect”的研究论文，该研究揭示了共转录折叠过程中普遍存在的结构转变以及新生和成熟RNA之间的整体结构相似性。此外，结合全基因组R环和突变率近似值进行的分析提供了定量证据，证明新生RNA折叠通过竞争性抑制R环发挥抗突变作用，已知R环有助于转录相关的诱变。综上所述，研究提出了真核生物共转录折叠的实验评估，并证明了新生RNA折叠的抗突变作用。这些结果表明，通过RNA折叠处理和传递遗传信息之间存在全基因组耦合。 背景介绍 二级结构是RNA分子的一个重要特征，是RNA转录、加工、翻译和降解等多种功能的先决条件。在细胞环境中，各种RNA结合蛋白和解旋酶的存在可以调节RNA折叠，使其超出RNA分子核苷酸序列所决定的热力学平衡。因此，在RNA分子生命周期的不同阶段可能形成不同的结构也就不足为奇了。例如，RNA一旦被转录就开始折叠（即共转录折叠）。由这种共转录折叠形成的新生RNA的结构已被证明可以调节选择性剪接，以及RNA合成的速度。除了抗突变的作用外，辅助转录新生RNA折叠的许多细节仍未被探索。例如，它是否总是在时间上与转录的进展耦合？成熟RNA中是否存在新生的RNA特异性结构？新生RNA的哪一段在体内表现出热力学或动力学决定的折叠？新生RNA结构的高通量评估应该有助于回答这些问题。在此背景下，最近的技术进步，特别是生化探测和高通量测序（HTS）的结合，促进了RNA二级结构及其生物学功能的全基因组研究。一些研究评估了真核生物中新生RNA的结构，但他们缺乏转录位点的信息阻碍了共转录折叠动力学的精细分辨率。迄今为止，唯一基于HTS的评估新生RNA共转录折叠的测定是细菌中引入的延长转录物（SPET-seq）的结构探测。然而，SPET-seq基于硫酸二甲酯（DMS），它不提供鸟嘌呤（G）或尿嘧啶（U）的结构信息，从而限制了生物学解释。 图文解析
图1 要点1： a.为了捕获酵母转录位点附近的新生RNA结构。将先前在原核生物中开发的转录本结构探测(SPET-seq)方法应用于真核生物，并进行了重大改进。首先，使用NAI-N3(一种能够修饰所有四种核苷酸(腺嘌呤(A)、U、G和胞嘧啶(C))的化学物质)来探测新生RNA中的单链碱基。 b.为了验证eSPET-seq的可靠性，研究人员在酿酒酵母BY4741菌株上进行了重复实验。发现eSPET-seq对每个基因捕获的reads数是高度可重复的(Pearson's R = 0.99,P<10-300)。 c-d.聚焦于每个核苷酸上平均RT stops≥1的基因，研究人员发现NAI-N3标记的RT stop位点和转录位点在重复实验中都高度一致。对于NAI-N3标记位点和转录位点，基因内位点间重复的Pearson's相关性至少分别为0.40和0.65。 e-f.为了进一步确认eSPET-seq的能力，将eSPET-seq数据与已知的RNA二级结构进行了比较。以谷氨酸tRNA为例，使用所有对应于相同转录位点的eSPET-seq reads对，从而对应于相同的转录中间体，来估计tRNA(见"方法")转录中间体内RT stops的分布。值得注意的是，3′端18个核苷酸由于被转录延伸复合体所覆盖，故不予考虑。eSPET-seq reads清楚地表明了已知tRNA二级结构中的单链区域，该区域在转录水平上形成了。
图2 要点2： a-b.以5S rRNA为例。与上述tRNA类似，研究人员对不同长度的转录中间体中相同核苷酸的RT停止密度进行了纵向比较。例如，当转录物长度达到～80 nt时，核苷酸30-45发生了明显的结构转变，这与5S rRNA中茎环结构的下游一半被转录后才可能发生的顺序折叠一致在结构转变之前( y < 80的片段)，RT在核苷酸30到45处的密度相对较低，这种模式与5S rRNA26上r环的存在相一致，其中新生RNA与模板DNA配对。转录产物中间<80 nt的R-loop的存在及其在转录进行到bb0 80 nt长度后的分解进一步通过DNA:RNA免疫沉淀(DRIP)和逆转录定量PCR证实(参见“方法”)。对于其他一些区域，如核苷酸1 - 25，转录后立即形成一个结构，随着转录的进行，该结构一直持续到5S rRNA的完整121 nt(图x的范围从1到25)。注意，在成熟的5S rRNA中观察到的核苷酸1-9和112-120之间的茎结构没有形成共转录，因为核苷酸110-120仍然受到RNA聚合酶II的保护。 c-d.为了对整个酵母转录组的结构转变进行更彻底的分析，提取每个核苷酸的RT终止密度的纵向剖面，并提供了必要的信息(5S rRNA的例子如图2c所示)。使用滑动窗口策略法来定位转录过程中重要的结构转变。有趣的是，研究人员发现结构转变是普遍存在的，因为在mRNA和ncRNA中分别观察到平均5.4%和31.7%的核苷酸具有必要的信息。
图3 要点3： a.这些基因中的大多数在新生RNA和成熟RNA之间表现出显著的结构相似性。这里的结构相似性是通过新生RNA和成熟RNA单链得分之间的Pearson相关系数来估计的。这一观察结果与RNA结构在很大程度上是顺式调节的观点是一致的，也就是说，RNA序列在热力学上是有利的。此外，假设反式调控元件，如RNA结合蛋白，应该对新生RNA和成熟RNA之间的差异负责，因为这两种类型的RNA分子在完全不同的细胞环境(细胞核和细胞质)中折叠。 b.为了验证假设，对成熟RNA的体外结构进行了额外的icSHAPE实验。由于反式调控因子在体外折叠过程中被耗尽，体内和体外反应性相似的NAI-N3基因应该主要是顺式调控结构，而其他基因应该主要是反式调控结构。因此，假设预测体内和体外结构高度相似的成熟RNA(即大部分是顺式调节的)在体内折叠时也应该具有相似的新生和成熟RNA结构，例如YKL056C。c.反之亦然，体内和体外结构相似性较低的成熟RNA(即大部分是反式调控的)在体内也应该具有不同的新生和成熟结构，如YPL250C。 d.与这一预测一致，体内和体外成熟RNA结构之间的结构相似性(单链分数的Pearson相关系数)可以很好地预测体内折叠的新生和成熟RNA结构之间的结构相似性。 e.为了进一步评估上述观察的分子机制，研究人员下载了一份由gPAR-CLIP(全局光激活-核糖核苷增强交联和免疫沉淀)实验推断的蛋白质和成熟RNA之间的体内相互作用列表。使用该数据集，发现体内和体外成熟RNA结构差异较小的50%基因与其他50%基因相比，往往具有更多的蛋白质结合位点(P=0.01,Mann-Whitney检验)。f.同样，体内新生和成熟结构差异较小的50%基因与其他50%基因相比，往往具有更多的蛋白质结合位点。这些结果表明，与成熟RNA相比，至少有一些独特的新生RNA结构可以用新生RNA折叠的独特细胞环境来解释，包括RNA结合蛋白的可用性。
图4 要点4： a.对一个酵母基因(CAN1)的研究表明，新生RNA折叠通过削弱转录过程中的R环来减轻突变。然而，到目前为止，还不可能对实验测量的新生RNA结构与R环或自发突变率之间的关系进行全基因组评估。 b-c.与假设模型一致，具有较高新生RNA结构流行率的基因确实具有较低的R-loop评分。值得注意的是，相应的相关性比以前用计算预测的新生RNA结构观察到的结果强一个数量级以上。 d-f.然后，在确认了自发DNA突变率与R-loop评分之间的预期关系之后，还发现新生RNA结构的流行率与突变率呈负相关(Spearman's ρ分别=-0.219和-0.156,P<10−19和10−9)，这也比基于预测的观察结果强得多(Spearman's ρ=-0.05)。 g.为了进一步研究R-loop在介导新生RNA结构抗诱变效应中的作用，计算了新生RNA结构的流行率与突变率之间的部分相关性，控制R-loop评分。负单链分数的偏相关系数ρ=−0.177(P<10−11)，单链分数的基尼系数ρ=−0.086(P<10−3)，分别表明约34.7%(=1−(−0.1772/−0.2192)和69.6%(=1−(−0.0862/−0.1562))的新生RNA折叠的抗诱变效应是通过R环介导的。考虑到大量的实验噪声，怀疑这些百分比可能被低估了，因此新生折叠的大部分反诱变子效应是通过R环介导的。 h.基因间比较的基因组分析可能会受到混杂因素(如基因表达水平)的影响，而基因内分析可以排除这些因素。因此，在每个基因中计算了三个比值比(OR)来评估三个估计之间的关系， i.单链评分与R-loop评分的关系为ORS-R,R-loop评分与突变率的关系为ORR-M，单链评分与突变率的关系为ORS-M。对于三个ORs，使用Cochran-Mantel-Haenszel卡方检验(MH检验)合并所有基因的ORs。)，发现所有三个组合的ORs都显著大于1。 j.此外，计算了三个估计值之间的平均基因内相关性，并发现它们与各自的零分布显著不同，这与假设一致。在这里，零分布是通过在每个基因中单独洗牌1000次来评估的。在突变积累实验中发生突变的位点与同一基因中未发生突变的位点相比，新生RNA结构的流行率更低，这一观察结果进一步支持了这些结果。总的来说，我们的分析揭示了新生RNA结构的流行率与R-loop或DNA自发突变率之间的反相关关系，从而提供了一个基于实验的、新生RNA折叠在基因组尺度上的抗突变效应的定量证据。
图5 要点5： a-b.为了进一步证实新生RNA折叠通过抑制R-loop的抗诱变作用，研发人员针对CAN1基因进行了操作实验，该基因编码一种精氨酸渗透酶，通常用于检测自发突变，并在其5'端前300nt处显示出清晰的R-loop信号。三种不同的CAN1同义突变体具有强、中、弱新生RNA折叠。 c.在新生RNA折叠更强的CAN1突变体中，自发突变率确实更低。 d.为了进一步验证新生RNA折叠降低突变率是通过抑制R环的形成来介导的，通过DRIP-RT-qPCR检测了这三个CAN1突变体5'端R环的发生率，发现新生RNA折叠越强，R环信号明显减少。 e-f.更重要的是，当稳定地过表达RNASEH1(通过降解R-loop中的RNA来阻碍R-loop的形成)时，三个版本CAN1的突变率或R-loop患病率的差异全部减弱或消失。总的来说，这些基于CAN1的操作实验证明了新生RNA折叠的R环依赖的抗突变子效应。
图6 要点6： a-d.为了回答新生RNA折叠的这种抗突变效应的生物学后果是什么?，估算了酵母蛋白编码基因的表达水平，并估算了它们序列的进化保守性(作为功能约束的替代指标)。当这两个指标与新生RNA结构的流行率进行比较时，研究人员一致发现正相关。更重要的是，当成熟RNA中结构的流行程度得到控制时，这些相关性仍然显著，这表明观察到的相关性不会被高表达基因中更普遍的mRNA结构所混淆。上述结果表明，高表达基因往往具有更普遍的新生RNA结构，因此可能导致高表达基因的进化较慢和遗传稳健性。 e-f.在每个基因中，计算了具有新生RNA结构最高流行率的一个50bp片段与具有新生RNA结构最低流行率的一个50bp片段之间的自发突变率降低的倍数。有趣的是，发现在高表达基因中突变率的折叠降低幅度更大，这表明新生RNA折叠对转录频率更高的基因的TAM缓解作用确实更强。然而，每个基因的突变率降低倍数(6.4±12)太小，以至于绝大多数基因的突变率降低倍数<40，因此只能产生很小的选择优势。这种选择优势小于酵母有效群体大小的反转，因此增加的新生RNA折叠不会被选择为酵母的适应性状。总的来说，对新生RNA折叠的抗突变效应的定量分析再次证明了eSPET-seq在进一步了解新生RNA结构方面的潜力。
图7 要点7： a-f.研究人员分析了公开获得的相关数据,发现一个基因中新生RNA结构流行率的两个指标，即单链得分的负相关和基尼指数，与该基因的R-loop得分、癌症突变概率和癌症突变密度均呈负相关。 g-h.重要的是，基因间比较发现的这些模式也一致得到基于MH试验的联合优势比的基因内分析的支持。总的来说，这些结果支持了新生RNA折叠在人类中的突变缓解作用，并提示新生RNA结构与癌症突变热点之间存在潜在的机制联系。 本文小结 综上所述，在目前的研究中，研究人员开发了eSPET-seq，这是一种专门设计用于探测转录位点附近四种RNA核苷酸(A,U,G和C)配对状态的实验方法，从而揭示新生RNA结构。基于eSPET-seq数据，发现了异质的共转录折叠率，新生RNA和成熟RNA结构之间的(非)相似性部分可以用RNA结合蛋白解释，以及新生RNA折叠通过溶解R环减轻TAM的假设的定量基因组证据。因此，eSPET-seq以前所未有的分辨率促进了对真核生物新生RNA折叠的理解，这在分子生物学和进化生物学中具有广泛的意义。 参考文献： Yu, G., Liu, Y., Li, Z. et al. Genome-wide probing of eukaryotic nascent RNA structure elucidates cotranscriptional folding and its antimutagenic effect. Nat Commun 14, 5853 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41550-w |
