IF=21.3 Nature Cell Biology│铁通过活跃的组蛋白去甲基化和mTORC1驱动合成代谢

IF=21.3 Nature Cell Biology│铁通过活跃的组蛋白去甲基化和mTORC1驱动合成代谢

前言

2023年9月25日，美国西北大学Hossein Ardehali教授的研究小组在Nature Cell Biology上发表了题为“Iron drives anabolic metabolism through active histone demethylation and mTORC1”的研究论文，研究发现铁结合组蛋白去甲基化酶KDM3B是一种内在的铁传感器，它通过在高亲和性亮氨酸转运体LAT3和RPTOR的增强子上去甲基化H3K9me2来调节mTORC1的活性。

背景介绍

研究人员报告了一个以前未描述的铁感知的真核途径，其中分子铁是维持活跃的组蛋白去甲基化和维持促合成代谢mTORC1途径的关键组分的表达所必需的。据介绍，所有真核细胞都需要一个最小的铁阈值来维持合成代谢。然而，细胞感知铁调节合成代谢过程的机制尚不清楚。

图文解析

图1

要点1：

a.第一种光合生物兴起后，地球大气的显著增氧导致了铁生物有效性的急剧降低。因此，铁缺乏(ID)已成为一种普遍现象，并在多个系统发育王国中进化出强大的调节系统，以维持对ID的生存。由于巨大的氧合事件先于地球上真核生物的进化，这就意味着真核生物之间必须共享一种额外的、进化上保守的机制来感知和响应铁限制。

b.在12 h时首次观察到(通过S6KT389磷酸化、4E-BP1带位移和TTP表达评估)对mTORC1活性的抑制。

c.这种抑制作用在10 µM以上急剧转变，进一步抑制检测到高达50 µM。研究人员没有观察到细胞内磷或钾水平的下降，表明即使在长时间的ID下，细胞也能够维持膜电位。d.在螯合18 h后加入等摩尔浓度的Fe2+、Cu2+或Zn2+，发现仅铁就足以恢复mTORC1活性。

e-g.接下来，研究人员评估了ID对主要的mTORC1调节的合成代谢和分解代谢过程的影响。去铁胺（DFO）处理减少了嘌呤霉素和35S蛋氨酸掺入到延长的肽链中，并降低了N-氨甲酰-L-天冬氨酸的细胞水平，与蛋白质和嘧啶合成的抑制相一致。h.DFO处理细胞也导致自噬的激活，表现为ULK1磷酸化降低，LAMP2水平和BECLIN1S15磷酸化增加，LC3-I转化为自噬标志物。i.荧光溶酶体染料Lysotracker Green在DFO或Torin1处理的细胞中的滞留量也增加。

j-k.值得注意的是，Torin1或24h DFO处理并没有导致贴壁细胞中明显的细胞死亡，这取决于碘化丙啶(PI)的摄取。

图2

要点2：

a.研究人员系统地评估了已知的营养和生长因子通路的关键元素在ID介导的mTORC1抑制中的潜在作用。血清饥饿条件下的铁螯合作用消除了血清饥饿后mTOR活性的恢复。

b-c.ID导致TSC2募集到溶酶体，与mTORC1抑制一致。

d-f.然而，尽管完全耐受血清饥饿，TSC2 KO HeLa细胞和Tsc2 KO MEFs在铁离子螯合后，S6KT389磷酸化水平降低，Ttp表达增加。

g.此外，研究人员在DFO处理的Arnt KO MEFs中证明了S6S240/244磷酸化的抑制，证实了HIF信号不是mTORC1抑制所必需的。

h.在DFO处理的REDD1 KD细胞中，同样观察到S6KT389磷酸化和TTP诱导的减少。

i.然而，在Ampkα1/2double KO(dKO)MEFs中，铁螯合仍然引起mTORC1抑制和Ttp表达增加。

j.嘌呤及其前体的减少也被证明对mTORC1活性有抑制作用；然而，ID增加了细胞肌苷、腺苷和腺嘌呤水平。

k.研究人员观察到葡萄糖、丙酮酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸的水平增加，同时伴随着αKG、延胡索酸和苹果酸的减少。

l.长时间的铁螯合后，细胞总ATP水平没有耗竭，表明ID细胞通过糖酵解维持足够的能量库。

m-n.接下来，研究人员用苹果酸二甲酯、β-烟酰胺单磷酸核糖(NMN)、天冬氨酸二甲酯或核苷混合物补充DFO处理的细胞。这些代谢物均不能挽救mTORC1的活性。

图3

要点3：

a.营养物质激活mTORC1需要其以AA依赖的方式募集到溶酶体表面。在DFO处理3 h的细胞中，AA剥夺后的AA再补充引起了mTORC1的完全再激活，而在18 h的细胞中则没有。

b-c.此外，研究人员观察到螯合18 h的细胞中mTOR与溶酶体解离，这不是由于溶酶体脱酸。这些数据表明，ID主动调节mTORC1的AA感应分支。

d.为了确定胞内AA水平是否受到ID的特异性调控，研究人员使用高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)分析了DFO处理的MEFs中16种AA的浓度，发现亮氨酸的水平显著降低，而甲硫氨酸和精氨酸的水平变化很小。

e-i.ID增加了SESTRIN2与WDR24的相互作用。此外，SESTRIN1/2/3三联体KO(SESN1/2/3t KO)和NPRL2 KO 293T细胞不响应亮氨酸水平的变化，尽管存在ID，但仍能保持完整的mTORC1活性。

j.此外，NPRL2 KO细胞对ID诱导的翻译抑制具有抵抗性，并且在ID诱导的NPRL2 KO细胞中嘌呤霉素的掺入相当于细胞缺乏亮氨酸。

k-l.ID也没有降低Rraga Q66L敲入(KI)MEFs中S6KT389的磷酸化，而RragaQ66L敲入(KI)MEFs同样具有抵抗亮氨酸缺失的能力。因此，铁对mTORC1的调控是通过SESTRIN、GATOR1/2和RAG蛋白的上游介导的，ID诱导的翻译抑制可能是mTORC1失活的下游结果。

图4

要点4：

a.亮氨酸是必需的AA，必须由细胞从细胞外环境中输入。然而，即使在超生理水平，DFO处理的细胞仍然对亮氨酸介导的mTORC1激活具有抵抗力。

b-c.ID显著抑制HEK293T细胞对14C-亮氨酸和MEFs对3H-亮氨酸的摄取。

d.相反，雷帕霉素抑制mTORC1引起亮氨酸摄取代偿性增加，表明亮氨酸摄取减少是ID的主要效应。

e.此外，抑制亮氨酸摄取并不是使用药理学螯合剂的结果。过表达强力霉素诱导FPN导致类似的亮氨酸摄取减少。

f-g.为了确定ID减少亮氨酸摄取的机制，研究人员检测了膜亮氨酸转运蛋白LAT1-4和溶酶体亮氨酸调节蛋白PAT1的mRNA水平。

h.LAT3和PAT1是唯一在DFO处理或过表达FPN的ID处理的各种细胞系中持续下调的转运蛋白。亮氨酸也可以通过SLC38A9参与的精氨酸依赖机制从溶酶体外排然而，Slc38A9在MEFs中的表达不随铁螯合作用而改变。

i.LAT3和PAT1抑制的时间点与S6KT389磷酸化的减少和TFRC mRNA的诱导相吻合。

j-k.研究人员相应地观察到DFO处理的HepG2和HeLa细胞膜组分中LAT3和PAT1蛋白水平降低。

l.此外，在添加FAC的铁缺乏HEK293T细胞中，LAT3和PAT1的水平得到恢复。

图5

要点5：

a.研究人员采用急性ID的体内模型，将断乳日龄的仔鼠(P21)随机分配到常规饮食(RD;250 ppmFe)或缺铁饮食(IDD)。2 ppmFe)，持续1 周.

b.两种饲料的铁含量通过ICP-MS进行确认。

c.ICP-MS检测结果显示，IDD7天导致肝脏铁含量降低62%。

d-e.脾脏裂解液(ID贫血的一个标志)的变色，以及肝脏Tfrc和FtlmRNA表达的特征性变化进一步证实了ID。

f.与体外实验结果一致，IDD喂养的小鼠肝脏中LAT3表达和S6KT389磷酸化水平降低。这些数据表明，在没有药物螯合作用的情况下，铁的生理性还原可以调节体内mTORC1的活性。

g-i.为了证实ID通过阻止亮氨酸摄取来调节mTORC1，研究人员使用了一种细胞通透性的亮氨酸形式(LLOME)。添加LLOME，而不是L-亮氨酸，足以完全挽救ID条件下的mTORC1活性，表现为S6KT389磷酸化的恢复和mTOR重新募集到溶酶体。

j.为了检测LAT3和/或PAT1是否足以抑制ID介导的亮氨酸转运，研究人员单独或共同敲低LAT3和PAT1。在HEK293T细胞中，敲低LAT3足以抑制mTORC1的活性。

k.该结构的过表达导致14C-亮氨酸摄取增加，证实了其功能性。

l.在TSC2 KO HeLa细胞中稳定过表达LAT3-HA，但不增强GFP(eGFP)，从而拯救了ID细胞中的mTORC1活性，而这一过程依赖于足够的胞外亮氨酸可供摄取。这些数据表明，LAT3的抑制对于ID抑制mTORC1是必要和充分的。

图6

要点6：

a.在调控表观遗传和转录的因子中，Jmj-C组蛋白去甲基化酶利用Fe2+和αKG进行催化。

b.铁螯合导致多个残基的组蛋白赖氨酸甲基化显著增加，包括H3K9、H3K27、H3K4和H3K36。

c-d.在与转录抑制相关的组蛋白标记中，研究人员观察到H3K9me2和H3K27me3甲基化的显著增加。

e-f.这些数据通过使用H3K9me2和总组蛋白H3(tH3)的特异性抗体进行免疫荧光验证，结果显示ID中H3K9me2荧光增强。

g.ID诱导的H3K9me2甲基化的时间与mTORC1抑制密切相关，并且在重新添加铁的情况下被逆转。然而，H3K27me3甲基化的水平并没有发生逆转，表明ID并不通过H3K27me3甲基化调节mTORC1的活性。

h.研究人员还观察到10 µM和20 µM DFO处理的细胞之间H3K9me2水平急剧增加。

i.尽管在Arnt KO MEFs中，基线H3K9me2水平较高，但ID仍然引起S6S240/244磷酸化的强烈抑制和H3K9me2水平的增加。

j.研究人员观察到在DFO处理的细胞中，H3K9me2峰的总数增加，主要位于内含子中。

k.与增加POLR2A募集的基因相比，约一半具有POLR2A峰值的基因没有占有率的变化，并且丢失POLR2A的基因数量超过两倍。

l.基因集富集分析(GSEA)揭示了与缺氧、糖酵解和mTORC1信号传导特征一致的特征。m.LAT3和PAT1均在其转录起始位点5 kb范围内的增强子区域富集了H3K9me2信号，并降低了POLR2A的占有率。

n.因此，一个或多个KDM家族成员的失活很可能是调控LAT3和PAT1位点H3K9me2水平的原因。

图7

要点7：

a.Jmj-C KDMs的同源物也存在于所有三个领域中。

b-e.在含有BPD的Murashige和Skoog培养基上生长时，铁螯合物阻止了层积种子的萌发和萌发后生长，以及5天龄幼苗中的根生长，这与拟南芥中的合成代谢阻滞(非生物胁迫)一致。

f.铁螯合也导致atTOR，atRAPTOR2，atRPL9A(TOR活性的转录标志物)和铁储存标记铁蛋白(atFER1)的抑制，而铁响应基因atPYE1和atFIT1的水平上调。

g.研究人员还观察到拟南芥S6K磷酸化的显著抑制，证明拟南芥中的TOR活性确实受到铁的调控。

h.在酿酒酵母中，ID导致TOR1，KOG1(RPTOR的同源物)和RPS26和RPL9A(TOR活性的转录靶点)的mRNA水平降低，而ID的标志物AFT1，FET3和CTH2上调，证实了有效的螯合作用，并降低了TOR活性。

i.与研究人员的稳态RNA数据一致，KOG1和TOR1的TR在铁螯合180 min内下降。

j.rph1Δ细胞在基础状态下表现出对TOR1和KOG1的部分抑制，而rph1Δjhd1Δjhd2Δ细胞在基础状态下表现出对TOR1和KOG1 mRNA的完全抑制，并且对ID没有反应。

k-l.这些发现与TORC1靶标Rps6的磷酸化水平一致，rph1Δ和rph1Δjhd1Δjhd2Δ酵母表现出对ID不敏感。

图8

要点8：

a.在Jmj-C去甲基化酶中，KDM3家族成员对H3K9me2和H3K9me1具有最突出的活性，以维持常染色质。

b.为了确定哪个KDM3成员负责感知细胞铁水平和调节mTORC1活性，利用规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas9在HEK293T细胞中删除KDM3A和KDM3B。

c.KDM3B KO细胞中mTORC1对ID无反应与LAT3和PAT1 mRNA抑制缺失有关。

d.在ID细胞中，KDM3B滞留在细胞核内，不与溶酶体结构结合。

e-f.KDM3B KO细胞的增殖和翻译速率在基线时显著降低，ID介导的蛋白质翻译抑制在KDM3B KO细胞中被消除。

g.研究人员利用亲和纯化的重组蛋白测定了KDM3A和KDM3B对铁离子的米氏常数(Km[Fe])。

h.KDM3B的Km[Fe]为100 ± 30 µM(比KDM3A高40倍)，表明KDM3B很可能在KDM3A之前响应细胞铁的减少。

i.最后，研究人员检测了在KDM3B KO细胞中重新表达WT KDM3B是否可以恢复对ID的敏感性。研究人员首先证实了研究人员的过表达结构正确定位于细胞核。

j.WT KDM3B的表达，而不是KDM3B的铁结合缺陷突变体(KDM3BH1560A)，恢复了DFO和IOX1对LAT3 mRNA的抑制以及IOX1对细胞抑制mTORC1活性的能力，表明KDM3B结合铁的能力是作为mTORC1活性的调节因子所必需的。

本文小结

综上所述，本次研究表明，在体外和体内，细胞内的铁水平足够低，从而导致对该蛋白的抑制。观察到该系统在系统性ID的小鼠和暴露于铁螯合剂的病人来源的原代肿瘤细胞中可以被激活，这突出了研究人员的发现的生理学意义。总的来说，研究人员的数据表明存在一种复杂的和进化上保守的铁传感机制，在ID延长的情况下参与关闭合成代谢过程。该通路对严重依赖铁和mTORC1介导的合成代谢的增殖性疾病具有深远的影响。

参考文献：Shapiro, J.S., Chang, HC., Tatekoshi, Y. et al. Iron drives anabolic metabolism through active histone demethylation and mTORC1. Nat Cell Biol 25, 1478–1494 (2023). https://doi.org/10.1038/s41556-023-01225-6