IF11.4 The EMBO Journal│在缺乏和存在外源性细胞外基质的情况下，人端脑类器官的形态发生和发育IF11.4 The EMBO Journal│在缺乏和存在外源性细胞外基质的情况下，人端脑类器官的形态发生和发育
前言 2023年9月14日，奥地利科学院分子生物技术研究所在The EMBO Journal上发表题为“Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix”的研究论文。本研究表明，在神经上皮早期阶段，暴露于可溶解的基底膜基质基质基质(Matrigel)会导致组织快速极化和神经上皮结构重排。在暴露于纯ECM成分或未暴露于任何外源性ECM的培养中，极性获取较慢，并由内源性ECM产生驱动。神经发生后，组织结构和神经元分化在很大程度上独立于最初的ECM来源，但Matrigel暴露对组织模式有长期影响。这些结果促进了对外源性和内源性引导的形态发生机制的了解，证明了神经上皮培养通过内源性过程的自我可持续性。 背景介绍 上皮形态发生是包括大脑在内的多种器官发育的关键步骤。在中枢神经系统中，当神经板产生神经管时，在神经形成过程中发生了重要的形态发生步骤。在该阶段，极化的神经上皮细胞在充满液体的心室腔附近呈现一个顶端结构域，在外神经管表面呈现一个基底结构域。类似的顶端-基底组织后来在皮质发生过程中被发现，当顶端放射状胶质细胞的极化能够使其他祖细胞和神经元群体在整个皮质板上分层组织。这些过程的受损会导致严重的神经发育缺陷。极化步骤依赖于来自邻近细胞和细胞外基质(ECM)蛋白的协调信号。特别是，基底膜蛋白是细胞表面相关的ECM，排列在上皮组织的基底层表面，提供启动和维持极性的线索。在大脑中，ECM的产生由不同的细胞类型进行，例如脑膜和神经祖细胞(NPCs)本身，ECM信号传导位于小鼠和人类不同的神经发育过程的核心。尽管它们在神经发育中起着核心作用，但在发育中的人脑细胞培养模型中，ECM的产生和细胞-ECM相互作用的过程仍未被充分研究。 图文解析
图1 要点1： A.分析时间点对应类器官发育的关键里程碑，从神经上皮形态发生的不同阶段开始，这一过程受到ECM信号的强烈影响。 B-C.为了评估类器官形态和大小，研究人员使用了纵向明场显微镜成像。D10时，EBs呈光滑圆形，组织外缘变亮，表明神经上皮已开始形成。在ECM存在的情况下，迅速观察到形态学变化。类器官在D13出现不规则形状，从D16开始可见组织出芽，在MG+D条件下最为明显。在没有ECM的情况下，类器官在前20天内保持球形并保持外层光亮。从1000多张图像中测量类器官直径。D10时，类器官直径在600~800 μm之间变化。从D13到D20，类器官直径在MG+D中增加更显著，其次是MG+L，最后是ex ECM-。在每个实验条件下，这些生长动态在同一细胞系的不同批次中具有可重复性，在所有4个细胞系中显示出轻微的差异。值得注意的是，明显的形态差异逐渐消失，在D40时，不同条件和细胞系中的类器官出现了相同的形态，ex ECM-类器官中也出现了清晰的组织出芽。
图2 要点2： A-E.为了了解ECM暴露如何改变神经上皮形态，评估神经祖细胞的早期组织。为了可视化单个NPCs在组织中的位置，使用H9来源的报告细胞系，其中绿色荧光蛋白的表达由SOX2启动子(SOX2::SOX2-p2A-EGFP,以下简称SOX2::EGFP)驱动，标记了真正的神经祖细胞。分析了含有80%H9野生型(WT)ESCs和20%H9 SOX2：：EGFP ESCs的类器官，因为这种混合比例足够稀疏，可以识别单个SOX2：：EGFP NPCs，同时也揭示了它们的整体组织分布。为了标记神经上皮顶端结构域，使用了非典型蛋白激酶C亚家族成员的免疫染色。在D10时，整个EB组织中出现了小的空洞区域-空化斑，表明结构不对称的初始点。然而，SOX2：：EGFP+神经祖细胞呈散在分布，缺乏清晰的组织结构，顶端-基底极性的方向尚不明确，PKCζ+染色在内外表面均有分布。ECM的暴露导致了快速的组织重排。在D13的3 天内，MG+D和MG+L类器官中的神经祖细胞被组织在神经玫瑰花环中，在由PKCζ+顶面划定的大的内部管腔(心室区)周围获得拉长的形态。相比之下，ex ECM-类器官保持了外顶端结构域和极少的内部小腔。然而，在D20时，具有较大髓腔和放射状祖细胞排列的神经玫瑰花结也广泛存在于exECM-类器官中。 F.为了量化这些观察，统计了所有细胞系的400多个类器官中，从D13到D20，每个横截面上PKCζ+神经玫瑰花环的数量。在液体包埋模式下，诱导玫瑰花结形成非常有效，从D13到D20，MG+L的神经玫瑰花结数量与MG+D类器官相当或更高。 G.为了更好地了解NPC极化的时间轴，评估了PKCζ和Fibronectin(FN)的位置，分别是顶端和基底结构域的标志物。该抗体可识别小鼠(Matrigel-derived)和人(内源性产生)来源的FN(Ms/h-FN)。包埋在ECM的液滴中导致在外类器官表面形成一个永久性的基底区域，如D13至D20 MG+D的FN周围的网格所见。基质胶在培养基中的溶解导致在类器官表面形成一层薄的ECM涂层，即使在MG+L暴露结束后一周仍然可见。在MG+条件中，D13和D16之间实现了PKCζ+/FN+表面的完全极化。值得注意的是，ex ECM-类器官在早期发育阶段表现出丰富的内源FN产生。直到D16，FN主要分布在exECM-类器官的组织中，而在D20，在神经玫瑰花环的PKCζ+管腔周围，建立了一个顶-基底轴，FN+区域呈圆形排列。在ex ECM-和MG+条件下，D20的FN+区域的模式有很大不同。 H.为了区分内源性ECM和ECM提供的ECM，使用了一种可以识别小鼠而不是人的层粘连蛋白-α1(Ms-LAMA1)的抗体；总之，使用能够同时识别小鼠和人(Ms/h)FN，LAMA1和串珠蛋白聚糖的抗体，这些已知的脑ECM成分在体内。在Execm类器官中，Ms-Lama1缺失，与预期一致；Ms/h-FN，LAMA1和串珠蛋白聚糖显示重叠表达，在神经玫瑰花环周围有斑点状图案，未达到类器官的最外表面-内源性产生ECM的标志。在MG+类器官中，光滑的FN+ LAMA1+串珠蛋白聚糖+表面与Ms-LAMA1共阳性，鉴定为Matrigel来源的ECM；此外，组织内可见Ms/h-ECM阳性但Ms-LAMA1阴性的斑点。 I.为了量化这些观察结果，分析了来自所有细胞系的88个类器官在D20的276个玫瑰花环。分割并测量了被内源性或外源性ECM覆盖的玫瑰花环周围区域的百分比。 J.由于在ECM液滴包埋和ECM液体包埋中都观察到了类器官形态的变化，因此采用了与MG+L条件相同的方法，将这些蛋白质溶解在培养基(2%V/V)中，从D13到D16。 K.为了评估细胞器的形态，采用了明场成像。有趣的是，Laminin+L和Coll.IV+L细胞器与exECM-细胞器相当，表面光滑，外表光亮，缺少MG+细胞器所见的出芽。为了评估小鼠Laminin与细胞器细胞的相互作用以及ECM的内源性产生，用Ms-LAMA1和Ms/h-LAMA1和Ms/h-串珠蛋白聚糖抗体对细胞器进行染色。在Laminin+L细胞器中可见较薄的Ms-LAMA1涂层，表明外源供给的小鼠Laminin在细胞器表面积累并与细胞器细胞相互作用。
图3 要点3： A.为了评估外源性ECM信号如何影响早期的类器官模式和基因表达谱，在D20进行了大量的RNA测序，从所有实验条件的单个H9来源的类器官。 B.此阶段类器官几乎全部由神经前体细胞(SOX2+)组成，第1个神经元(MAP2+)开始分化。 C.为了评估组织身份，验证了共同标记基因的表达。 D-E.为了鉴定假定的差异，进行了差异基因表达分析。在MG+D和exECM-条件之间仅发现28个基因差异表达(DE)，考虑所有成对比较的38个基因。在MG+条件下下调的基因没有产生任何GO富集。在MG+条件下上调的基因与眼睛发育和形态发生相关，并且这种特征在MG+D中比在MG+L类器官中更强。值得注意的是，卷曲基因-5(FZD5)和成纤维细胞生长因子结合蛋白3(FGFBP3)基因在MG+类器官中表达上调，表明ECM中存在的Wnt和FGF配体可能影响组织模式。
图4 要点4： A.鉴于ex ECM-、Laminin+L和Coll在形态和转录水平上的相似性。IV+L类器官，进一步实验仅比较ex ECM-、MG+L和MG+D条件。为了评估神经上皮形态发生的初始差异是否影响早期神经发生阶段，评估了D40的组织结构。在这一阶段，所有明场成像的条件下均可见显著的神经玫瑰花结。 B.为了评估细胞组织，使用了神经祖细胞和神经元标记物的免疫染色。在所有条件下，SOX2+神经祖细胞呈放射状排列在大管腔周围，并被大量的MAP2+神经元包围。 C.此外，玫瑰花环具有背侧皮质的特征和放射状胶质细胞(SOX2+)、中间祖细胞(TBR2+)和早期产生的兴奋性神经元的典型的由内向外的结构。 D.由于程序的可变性或未知的外源性线索导致的组织错误图案化会导致类器官内出现不需要的区域命运。在检查D40的类器官形态时，发现了神经玫瑰花结中没有组织的区域，出现了更加曲折和无序的。OTX2和TTR在这些区域的共表达表明了的视杯特性。 E-F.为了进一步量化这些形态特征，测量了超过250个类器官的直径，并量化了190个类器官中大约8000个莲座的面积和数量。分析发现，MG+D类器官显著大于exECM-，莲座面积显著大于exECM-，而MG+L与exECM-差异较小或不显著。 G.另一方面，ex ECM-类器官比MG+D类器官具有更高的莲座数目。 H.通过量化190个类器官中每个类器官中OTX2+组织面积的百分比，发现OTX2+区域的百分比在MG+中显著高于exECM-类器官，其中在MG+D条件下扩张最为显著。
图5 要点5： A-H.体外建模的主要目标之一是获得发育中神经元组织的成熟特征。因此，为了评估外源性ECM的不同早期暴露对类器官成熟的潜在长期影响，研究了存在不同类型成熟神经元的发育阶段(D120)类器官的细胞组成。值得注意的是，虽然此时的类器官组织已经完全超过了早期添加的ECM，但在MG+D类器官中仍然可见大的固体形成，或者在MG+ L类器官中作为小的残留物。为了对细胞类型组成进行无偏性分析，采用单细胞RNA测序，重点关注H9来源的类器官和每个条件下的3个类器官。为了保留每个细胞的类器官起源信息，使用了独特的分子标识符寡核苷酸标记和测序后的计算解复用技术；大多数回收的细胞具有独特的条形码，产生14.5 k的高质量细胞用于进一步分析。虽然exECM-类器官小于MG+L和MG+D类器官，但没有发现其他相关的形态学差异。在UMAP投影中的无监督聚类确定了两个主要的聚类。差异基因表达分析显示，最丰富的簇包含FOXG1+终脑的细胞，而第二个簇为非终脑的标记阳性，包括OTX2和RAX，且多起源于单个MG+D类器官。因此，第二个簇代表了在D20和D40时MG+D类器官中已经占优势的视杯的错误分化。在过滤掉低质量细胞和去除non-终脑的簇后，分离了分裂NPCs和放射状胶质祖细胞(RGs)，少突胶质前体细胞(OPCs)，中间神经元(INs)，中间祖细胞(IPCs)，未成熟兴奋性神经元(ExNs)，深层ExNs(ExNs DL)和上层ExNs。每个簇用细胞型特异性标记基因的表达进行标记。对每簇细胞百分比的计算表明，腹侧前体细胞和中间神经元的丰度略有变化。 I.为了验证所有细胞系和条件下的细胞类型组成，在D120处进行了免疫染色。类器官主要由深层和上层的Ex Ns(CTIP2+和SATB2+)组成，具有残存的层状组织。在所有条件和细胞系中都发现了中间神经元与ExNs的混合。 J-K.为了量化潜在的模式差异，测量了所有细胞系的大约100个类器官中终脑的/non-终脑的和背部/腹部组织之间的比例。FOXG1(端脑)和OTX2(非端脑的阳性面积比例显示，对于所有细胞系和批次，大部分组织为FOXG1+。然而，MG+D条件导致OTX2+终脑的区域扩大，最显著的是H9-和iPSCs#2来源的类器官。增加的错误图案化主要由暴露于ECM基质胶驱动，而非细胞系依赖性。由于中间神经元常与兴奋性神经元混杂在一起，在一个类器官内并不总能划定背侧和腹侧区域。因此，将核标记SATB2和DLX2作为背腹细胞的代用指标，可以对进行分段计数。有趣的是，该分析揭示了背/腹模式独立于ECM暴露。相反，存在细胞系依赖性，其中一些细胞系显示出产生更多中间神经元的内在趋势。 本文小结 综上所述，本研究探讨了端脑类器官暴露于外源性ECM制剂、基质、层粘连蛋白和IV型胶原对神经上皮形成阶段的影响。对早期的类器官组织进行了详细的形态学分析，主要集中在顶基极性和ECM组成上，但没有探索玫瑰花结形成的确切分子机制。在未来，对空化和极化过程进行更详细的生化表征，再加上PSC衍生的类器官在早期阶段的实时成像，以可视化组织形态发生。 参考文献： Martins-Costa C, Pham VA, Sidhaye J, Novatchkova M, Wiegers A, Peer A, Möseneder P, Corsini NS, Knoblich JA. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 2023 Oct 16:e113213. https://doi.org/10.15252/embj.2022113213
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