单细胞ATAC测序ATAC-seq(Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing)，即利用转座酶研究染色质开放性的高通量测序技术。染色质开放区域是染色质中呈松散状态、可发生DNA复制和基因转录的区域，ATAC-seq 使用改造 Tn5转座酶，捕获染色质开放区，将测序接头引入开放染色质的两端，用于表观遗传、基因调控研究。 技术应用： 1. 染色质开放区域图谱绘制； 2. 多种肿瘤样本染色质开放区域比较； 3. 比较进化过程中谱系细胞的增强子差异； 4. 比较不同处理的转录因子结合情况差异； 5. 病变组织与正常组织的染⾊质开放性比较； 6. 在ATAC-seq上计算发现具有细胞特异性活性的细胞特异性结合位点和转录因子 技术原理： 10x单细胞ATAC测序其技术原理为利用T字型微流控系统分离单细胞核，然后通过Gel Beads上的barcode标记转座酶切割的DNA。10x单细胞ATAC测序其技术被广泛应用于多个研究领域，例如肿瘤异质性研究、基因调控网络分析、细胞谱系示踪、生物标记物发现等。 技术优势： 通量大：8通道微流体系统，每一个通道可以处理500-10000个细胞核； 效率高：细胞核捕获率超过65%； 线粒体序列污染低：GM12878细胞系测试结果小于2%； 兼容性高：10X ATAC文库可同时兼容NovaSeq, HiSeq, NextSeq和MiSeq等平台； 样品涵盖范围广：可以处理细胞系、原代细胞、新鲜样品和冻存样品； 结果展示方便：提供Loupe Browser可视化交互软件。 建库流程scATAC-seq作为ATAC-seq的升级版，可以在单细胞的水平上明确细胞分化过程开放性染色质有什么差异，调控了哪些信号通路等等。 通常建库流程主要分为5步：核裂解、转座、单细胞标记、标记后孵育及文库构建。 细胞核裂解 目前10X官网上有一些人类及小鼠组织的提核方案，但是针对于植物的方案较少，因此做植物的人还是需要查阅大量的文献去对应自己研究的组织部位，获得适宜于该研究的buffer，来进行后续的研究。 与普通ATAC一样，细胞核裂解可以选用buffer直接裂解和流式分选获得单个细胞核，如其他的一些方法（LCM，磁珠吸附），但相对于细胞核的通量较低。 转座细胞核悬浮液中加入含有Tn5转座酶的混合液，随后开始进行孵育。孵育中转座酶进入细胞核，与染色质开放区进行结合，将 DNA 片段化。同时，将接头序列结合到 DNA 片段的末端。 单细胞标记 单细胞ATAC组学与普通ATAC组学主要的区别是在建库的时候对每个细胞进行标记建库，随后进行文库构建，在进行后续分析时可以获得单个细胞的染色质可及性水平。 因此在进行单细胞标记时会给每个细胞分配一种胶珠（barcode），给每种细胞进行定性及定量。 标记后孵育 选用硅烷磁珠用于去除GEM反应后混合物中残留物，同时选用SPRI磁珠用于吸附样品中没有结合的barcode。 文库构建 按照推荐的构建文库的PCR体系，加入P7和引物，循环扩增后获得ATAC文库，将最终的文库进行测序。
10x Genomics 单细胞ATAC测序生信分析 1、序列分析：将测序读段比对到基因组，并删除重复的reads。 2、峰发现： 使用MACS 2.1.0，将双端测序中的两个reads用于peak calling。 3、片段密度的确定： 为了鉴定基因组的转座事件的密度，将基因组分为32 bp的条带，并确定每个条带中的片段数。为此，将reads扩展到200 bp以使数据平滑。 4、通过随机采样对所有样本的比对reads数进行归一化，以使每一个样本包含所有样本中比对reads数最少的样本相同数目的reads。 5、活动区域分析： 为了比较两个或多个样本之间的峰，将重叠的峰分组为“活动区域”，这是由最上游峰的起始坐标和最下游峰的终止坐标定义的专有度量。 样本要求 （一）细胞样本 1、细胞总量: 最初解离出的的细胞悬液，样本细胞起始量建议大于1X105个，若是准备10X仪器捕获前的细胞，建议最少细胞量是目标捕获细胞数的3-4倍； 2、细胞浓度: 700-1200细胞/μl； 3、细胞活性: 细胞活性建议85%以上； 4、细胞直径: 细胞直径小于40μm(7-30μm) ； 5、细胞悬液碎片率低于10%，无细胞黏连； 6、细胞悬液无红细胞； 7、细胞培养基及缓冲液不含有 Ca2+和Mg2+等影响酶活性的物质； 8、植物、真菌样本需要制备成原生质体； 9、单细胞悬液需要在30min内进行标记操作，超过30min会影响细胞活性，且需要重新测定细胞活率及细胞浓度。 （二）组织样本 1、提前与所负责的业务人员联系，获取组织保存液（2ml/样本，可根据组织块大小增加）; 2、切取>0.2g (黄豆大小) 新鲜组织，单块组织体积不能超过0.5cm； 3、剔除坏死损伤组织； 4、将获取的组织用1XDPBS洗掉组织中的血液； 5、将清洗后的组织样本置于加满的提前预冷的组织保存液的离心管中，使用封口膜将离心管封闭好，于2-8℃保存/运输。 |
